SRAS

Nature volumen 592, páginas 277–282 (2021)Cite este artículo

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La proteína de pico del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática es crítica para la infección del virus a través del compromiso de la proteína ACE2 humana1 y es un objetivo importante del anticuerpo. Aquí mostramos que la infección crónica con SARS-CoV-2 conduce a la evolución viral y a una sensibilidad reducida a los anticuerpos neutralizantes en un individuo inmunodeprimido tratado con plasma convaleciente, generando secuencias ultraprofundas de todo el genoma durante 23 puntos de tiempo que abarcan 101 días y usando Técnicas in vitro para caracterizar las mutaciones reveladas por secuenciación. Hubo pocos cambios en la estructura general de la población viral después de dos ciclos de remdesivir durante los primeros 57 días. Sin embargo, después de la terapia con plasma de convalecencia, observamos grandes cambios dinámicos en la población viral, con la aparición de una cepa viral dominante que contenía una sustitución (D796H) en la subunidad S2 y una deleción (ΔH69/ΔV70) en la subunidad S1 N- dominio terminal de la proteína de pico. A medida que los anticuerpos séricos transferidos pasivamente disminuyeron, los virus con el genotipo de escape redujeron su frecuencia, antes de regresar durante un ciclo final, fallido, de tratamiento con plasma de convalecencia. In vitro, el mutante doble de pico que porta tanto ΔH69/ΔV70 como D796H confirió una sensibilidad modestamente disminuida al plasma de convaleciente, al tiempo que mantuvo niveles de infectividad que eran similares a los del virus de tipo salvaje. El mutante de sustitución de pico D796H pareció ser el principal contribuyente a la disminución. susceptibilidad a los anticuerpos neutralizantes, pero esta mutación resultó en un defecto de infectividad. El mutante de eliminación de picos ΔH69/ΔV70 tenía un nivel de infectividad dos veces mayor que el SARS-CoV-2 de tipo salvaje, lo que posiblemente compensa la infectividad reducida de la mutación D796H. Estos datos revelan una fuerte selección del SARS-CoV-2 durante la terapia con plasma de convalecientes, que se asocia con la aparición de variantes virales que muestran evidencia de una susceptibilidad reducida a los anticuerpos neutralizantes en individuos inmunodeprimidos.

Un hombre septuagenario ingresó en un hospital terciario en el verano de 2020 y había dado positivo por SARS-CoV-2 mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) 35 días antes en un hisopo nasofaríngeo (día 1) en un hospital local. (Datos ampliados, figuras 1, 2). Su historial médico incluía linfoma marginal de células B diagnosticado en 2012, con quimioterapia previa que incluía vincristina, prednisolona, ​​ciclofosfamida y depleción de células B anti-CD20 con rituximab. Es probable que tanto la quimioterapia como el linfoma subyacente hayan contribuido a la inmunodeficiencia combinada de células B y T (Datos ampliados, figuras 2, 3 y tabla complementaria 1). La tomografía computarizada de tórax mostró anomalías generalizadas compatibles con neumonía asociada con la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) (Figura 1 complementaria). El tratamiento incluyó dos ciclos de remdesivir de 10 días con un intervalo de 5 días entre ellos (Datos ampliados, figura 1). Se administraron dos unidades de plasma convaleciente los días 63 y 65 (Datos ampliados, figura 3). Después del deterioro clínico, se administraron remdesivir y una unidad de plasma de convaleciente el día 95, pero el individuo murió el día 102 (Nota complementaria).

La mayoría de las muestras fueron muestras respiratorias de nariz y garganta o aspirados endotraqueales durante el período de intubación (Tabla complementaria 3). Los valores del umbral del ciclo (Ct) oscilaron entre 16 y 34 y las 23 muestras respiratorias se secuenciaron con éxito mediante un enfoque estándar de secuenciación de una sola molécula según el protocolo ARTIC implementado por The COVID-19 Genomics UK (COG-UK; https://www .cogconsortium.uk/) Consorcio; de estas muestras, 20 se sometieron además a una secuenciación profunda de lectura corta utilizando la plataforma Illumina (Tabla complementaria 4). Hubo un acuerdo general entre los dos métodos (Datos ampliados, figura 4). Sin embargo, debido a la mayor confiabilidad de Illumina para variantes de baja frecuencia, esto se utilizó para el análisis formal2,3. Además, se utilizó la amplificación de un solo genoma y la secuenciación de picos utilizando ARN extraído de muestras respiratorias como método independiente para detectar las mutaciones observadas (Datos ampliados, figura 4). Finalmente, no detectamos evidencia de recombinación, según dos métodos independientes (datos no mostrados).

El análisis de máxima verosimilitud de secuencias consenso del genoma completo derivadas de pacientes demostró agrupación con otras secuencias locales de la misma región (Fig. 1). La cepa infectante se asignó al linaje 20B que porta la variante Spike (D614G). El muestreo ambiental mostró evidencia de virus en superficies como el teléfono y el timbre de llamada. La secuenciación de estos virus de superficie mostró agrupación con los derivados del tracto respiratorio (Datos ampliados, figura 2). Todas las muestras coincidían con haber surgido de una única población viral subyacente. En nuestro análisis filogenético, incluimos secuencias secuenciales de otros tres pacientes locales identificados con eliminación persistente de ARN viral durante un período de 4 semanas o más, así como dos individuos inmunodeprimidos a largo plazo recientemente informados con SARS-CoV-24,5 (Datos ampliados Fig. 2 y Tabla complementaria 2). Mientras que las secuencias de los tres pacientes locales, así como uno de los estudios previos5, mostraron poca divergencia sin cambios de aminoácidos en la proteína de pico a lo largo del tiempo, el paciente caso (en adelante, paciente X1) mostró una diversificación considerable. El otro paciente 4, previamente informado, mostró un grado similar de diversificación que el paciente X1. Una investigación adicional de los datos de la secuencia sugirió la existencia de una estructura subyacente a la población viral en el paciente X1, con muestras recolectadas en los días 93 y 95 que estaban enraizadas dentro de la población original, pero divergían de ella (Datos ampliados, figuras 5, 6). La relación de las muestras divergentes con las de momentos anteriores va en contra de la sobreinfección.

El árbol filogenético circularizado de máxima verosimilitud se basa en la secuencia de referencia Wuhan-Hu-1, que muestra un subconjunto de 250 genomas locales de SARS-CoV-2 de GISAID. Este diagrama resalta la considerable diversidad del paciente X1 (verde) en comparación con otros tres pacientes locales con muda prolongada (los pacientes C1-C3 se muestran como secuencias rojas, azules y moradas, respectivamente). Todos los genomas del SARS-CoV-2 'Reino Unido/inglés' se descargaron de la base de datos GISAID y se seleccionó un subconjunto aleatorio de 250 secuencias como fondo (que se muestra en negro).

Todas las muestras dieron positivo para SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR y no hubo cambios sostenidos en los valores de Ct durante los 101 días posteriores a los dos primeros ciclos de remdesivir (días 41 y 54) o las dos primeras unidades de plasma de convaleciente con policlonal. anticuerpos (días 63 y 65) (Datos ampliados, Fig. 3). En particular, no pudimos cultivar virus a partir de muestras de hisopos almacenadas. Las secuencias de consenso de datos de Illumina de secuenciación profunda de lectura corta revelaron cambios dinámicos en la población después del día 65, como se muestra en un gráfico resaltado (Datos ampliados, figura 6). Además, también pudimos seguir la dinámica de las poblaciones de virus hasta bajas frecuencias durante todo el período (Fig. 2 y Tabla complementaria 4). Después del tratamiento con remdesivir el día 41, el análisis de variantes de baja frecuencia mostró cambios transitorios de aminoácidos en poblaciones con una abundancia inferior al 50 % en el marco de lectura abierto (ORF) 1b, 3a y pico, con una mutación C27509T (que causa una sustitución T39I) en orf7a. alcanzando el 79% el día 45 (Fig. 2 e información complementaria). Descubrimos que una sustitución I513T (codificada por T2343C) en NSP2 y una sustitución V157L (codificada por G13936T) en RdRp habían pasado de ser indetectables en el día 54 a casi un 100% de frecuencia en el día 66 (Fig. 2), con la mutación en el siendo la polimerasa el candidato más plausible para impulsar este barrido. En particular, el pico (N501Y), que puede aumentar la afinidad por el receptor ACE26 y que está presente en el linaje B1.1.7 del Reino Unido7, se observó el día 55 con una frecuencia del 33 %, pero fue eliminado por el barrido del NSP2 y Variante RdRp.

Los datos se basan en valores de secuenciación ultraprofunda de lectura corta de Illumina con una cobertura de 1000×. Las variantes mostradas alcanzaron una frecuencia de al menos el 10% en al menos dos muestras. PC: plasma de convaleciente; RDV, remdesivir. Las sustituciones de aminoácidos descritas en el texto se indican mediante etiquetas que utilizan el mismo color que la posición en el genoma (se incluyen proteínas asociadas para cada nombre). Las variantes etiquetadas están representadas por líneas discontinuas. a, Variantes detectadas en el paciente X1 los días 1 a 82 después de la primera prueba RT-qPCR positiva para SARS-CoV-2. Spike(D796H*) (azul claro) tiene la misma frecuencia que NSP3(K902N) (naranja) y, por lo tanto, está oculto debajo de la línea naranja. b, Variantes detectadas en el paciente X1 los días 82-101.

A diferencia del período inicial de infección, entre los días 66 y 82, después de las dos primeras administraciones de sueros de convalecientes, se observó un cambio en la población del virus, con una variante con una sustitución D796H en S2 y una deleción ΔH69/ΔV70 en el El dominio N-terminal (NTD) S1 de la espiga se convirtió en la población dominante el día 82. Esto se identificó en una muestra de hisopo de nariz y garganta con alta carga viral, como lo indica un valor de Ct de 23 (Fig. 3a). La eliminación se detectó transitoriamente al inicio del estudio basándose en una secuenciación profunda de lectura corta. La eliminación de ΔH69/ΔV70 se debió a una eliminación de seis nucleótidos fuera del marco, lo que da como resultado que la secuencia del codón 68 cambie de ATA a ATC.

a, Al inicio del estudio, las seis variantes de pico (secuenciación de Illumina) excepto el pico (ΔH69/ΔV70) estaban ausentes (menos del 1 % y menos de 20 lecturas). Aproximadamente dos semanas después de recibir dos unidades de plasma convaleciente, las poblaciones virales portadoras de pico (ΔH69/ΔV70) y pico (D796H) aumentaron a frecuencias de más del 80 %, pero disminuyeron significativamente 4 días después. Esta población fue reemplazada por una población con pico (Y200H) y pico (T240I), detectada en dos muestras durante un período de 6 días. Luego, estas poblaciones virales fueron reemplazadas por virus portadores de pico (W64G) y pico (P330S), que dominaron el día 93. Después de un tercer ciclo de remdesivir y una unidad adicional de plasma convaleciente, el pico (ΔH69/ΔV70) y el pico ( D796H) la población de virus resurgió para convertirse en la cepa viral dominante alcanzando frecuencias de variantes de más del 75%. Pares de mutaciones surgieron y desaparecieron simultáneamente, lo que indica un vínculo en el mismo haplotipo viral. Los valores de Ct de muestras respiratorias se indican en el eje y derecho (línea discontinua negra y triángulos). En los casos en los que hubo lecturas duplicadas el mismo día, para mantener la coherencia, se trazaron muestras de hisopos de nariz y garganta. b, Árbol filogenético de máxima verosimilitud del paciente X1 con el día de muestreo indicado. Las mutaciones de pico que definen cada uno de los clados se muestran ancestralmente en las ramas en las que surgieron. En las fechas en las que se recogieron múltiples muestras, estas se indican como aspirado endotraqueal (ETA) e hisopos de nariz y garganta (N+T).

En los días 86 y 89, los virus obtenidos de muestras del tracto respiratorio superior se caracterizaron por el doble mutante pico (Y200H, T240I), y el par mutación-deleción (pico (D796H, ΔH69/ΔV70)) observado el día 82 disminuyó a frecuencias del 10% o menos (Figs. 2, 3). Spike (Y200H, T240I) estuvo acompañado en alta frecuencia por otras tres variantes no sinónimas con frecuencias alélicas similares, que codifican I513T en NSP2, V157L en RdRp y N177S en NSP15 (Fig. 2a). Ambos también se observaron previamente con una frecuencia de más del 98% en la muestra el día 66 (Fig. 2a), lo que sugiere que este nuevo linaje surgió de una población que existía anteriormente.

La secuenciación de una muestra de hisopo de nariz y garganta el día 93 identificó virus caracterizados por un pico (P330S) en el borde del dominio de unión al receptor (RBD) y un pico (W64G) en el NTD S1 con una abundancia cercana al 100%, mientras que el pico ( D796H, ΔH69/ΔV70) mostraron una abundancia inferior al 1% y las variantes pico(Y200H) y pico(T240I) tuvieron frecuencias inferiores al 2%. Se detectaron virus con la variante Spike (P330S) en dos muestras independientes de diferentes sitios de muestreo, lo que argumenta en contra de la posibilidad de contaminación. La divergencia de estas muestras con respecto al resto de la población (Figs. 2, 3b y Datos ampliados, Figs. 5, 6) sugiere la posibilidad de que representen una subpoblación compartimentada.

Los patrones en las frecuencias de las variantes sugieren competencia entre poblaciones de virus que portan diferentes mutaciones; Los virus con el pico del par mutación-deleción (D796H, ΔH69/ΔV70) aumentaron a una alta frecuencia durante la terapia con plasma convaleciente, pero luego fueron superados por otra población en ausencia de terapia. Específicamente, estos datos son consistentes con un linaje de virus con la variante NSP2(I513T) y RdRp(V157L), que fue dominante el día 66 pero fue superada durante la terapia por la variante de mutación-deleción. Con el lapso en la terapia, la cepa original, que había adquirido NSP15 (N1773S) y la espiga (Y200H, T240I), recuperó el dominio, seguida por el surgimiento de una población separada con la variante espiga (W64G, P330S).

En un último intento por reducir la carga viral, se administró un tercer ciclo de remdesivir (día 93) y una tercera dosis de plasma de convaleciente (día 95). Observamos la reaparición de la población viral de pico (D796H, ΔH69/ΔV70) (Figs. 2, 3). El vínculo inferido de pico (D796H) y pico (ΔH69/ΔV70) se mantuvo como lo demuestran las frecuencias muy similares de las dos variantes, lo que sugiere que la tercera unidad de plasma convaleciente condujo al resurgimiento de esta población bajo una selección positiva renovada. . Para respaldar aún más nuestra idea propuesta de competencia, las frecuencias de estas dos variantes parecieron reflejar los cambios en la variante NSP2 (I513T) (Fig. 2), lo que sugiere que estas variantes son marcadores de clados opuestos en la población viral. Los valores de Ct se mantuvieron bajos durante todo este período con hiperinflamación, lo que finalmente condujo a una falla multiorgánica y la muerte el día 102. El aumento repetido en la frecuencia de la población viral con terapia de plasma convaleciente apoya firmemente la hipótesis de que la combinación de la deleción y la mutación en la proteína de pico confirió una ventaja selectiva.

Utilizando pseudotipado lentiviral, generamos proteínas de pico de tipo salvaje, pico (D796H, ΔH69/ΔV70) y pico mutante único en viriones envueltos para medir la actividad de neutralización del plasma convaleciente contra estos virus (Fig. 4). Se ha demostrado que este sistema proporciona resultados generalmente similares a los de los virus con capacidad de replicación8,9. La proteína de pico de cada mutante se detectó en los viriones sedimentados (Fig. 4a). También utilizamos un anticuerpo VIH-1 (p24) para controlar los niveles de producción de partículas lentivirales (Fig. 4a y Fig. 2 complementaria). Luego medimos la infectividad de los pseudovirus, corrigiendo la entrada del virus usando mediciones de la actividad de la transcriptasa inversa, y descubrimos que la espiga (ΔH69/ΔV70) parecía tener una infectividad dos veces mayor en una sola ronda de infección en comparación con la espiga de tipo salvaje (Fig. .4b y Datos ampliados Fig. 7). Por el contrario, el mutante único de pico (D796H) tenía una infectividad significativamente menor en comparación con la proteína de pico de tipo salvaje y el mutante doble (pico (D796H, ΔH69 / ΔV70)) tenía una infectividad similar a la proteína de pico de tipo salvaje (Fig. 4b y Datos ampliados Fig. 7).

a, Western blot de sedimentos de virus después de la centrifugación de sobrenadantes de células transfectadas con plásmidos de pseudotipado lentivirales que incluían la proteína de pico. Las transferencias son representativas de dos transfecciones independientes. b, Infectividad de ronda única de lentivirus que expresan luciferasa pseudotipados con la proteína de pico (tipo salvaje (WT) o mutante) del SARS-CoV-2 en células HEK293T cotransfectadas con plásmidos ACE2 y TMPRSS2. La infectividad se corrige según la actividad de la transcriptasa inversa en el sobrenadante del virus, medida por qPCR. Los puntos de datos representan réplicas técnicas (n = 3). Los datos son media ± sem de dos experimentos independientes. RLU, unidades de luz relativas; nU, nanounidad. c – e, Potencia de neutralización de unidades de plasma convaleciente (CP1 – CP3) contra virus pseudotipados que contienen picos (D796H), picos (ΔH69/ΔV70) y picos (D796H, ΔH69/ΔV70). f, g, potencia neutralizante del suero del paciente X1 contra virus pseudotipados que contienen pico (D796H), pico (ΔH69/ΔV70) y pico (D796H, ΔH69/ΔV70). Se tomó suero del paciente en los días indicados. Se muestra la dilución de suero necesaria para inhibir el 50% de la infección por virus (ID50), expresada como un cambio en veces con respecto al virus de tipo salvaje. Los puntos de datos representan medias de réplicas técnicas (barras horizontales) obtenidas en experimentos independientes (n = 2–6).

Datos fuente

Descubrimos que el mutante doble pico (D796H) solo y pico (D796H, ΔH69 / ΔV70) eran menos sensibles a la neutralización mediante muestras de plasma convaleciente (Fig. 4c-e y Datos ampliados Fig. 7). Por el contrario, el mutante único pico (ΔH69/ΔV70) no redujo la sensibilidad de neutralización. Además, el suero derivado del paciente de los días 64 y 66 (un día antes y después de la infusión con la segunda terapia de plasma convaleciente) mostró de manera similar una menor potencia contra el doble mutante pico (D796H, ΔH69 / ΔV70) (Fig. 4f, g) .

Anteriormente se identificó un panel de diecinueve anticuerpos monoclonales aislados de tres donantes para neutralizar el SARS-CoV-2. Para establecer si las mutaciones que ocurrieron in vivo (pico (D796H) y pico (ΔH69/ΔV70)) dieron como resultado un cambio global en la sensibilidad de neutralización, probamos anticuerpos monoclonales neutralizantes dirigidos a los siete principales grupos de epítopos que se han descrito previamente (excluyendo el los grupos no neutralizantes II y V y los pequeños (n ≤2) grupos neutralizantes IV y X). Los ocho anticuerpos monoclonales específicos de RBD (Datos ampliados, figura 8) no mostraron cambios importantes en la potencia de neutralización y el anticuerpo COVA1-21 no específico de RBD mostró una reducción de 3 a 5 veces en la potencia contra el pico (D796H, ΔH69/ΔV70 ) y pico (ΔH69/ΔV70), pero no solo contra pico (D796H)9 (Datos ampliados, figura 8). No observamos diferencias en la neutralización entre los mutantes simples o dobles y la proteína de pico de tipo salvaje, lo que sugiere que el mecanismo de escape probablemente estaba fuera de estos epítopos en el RBD. Estos datos confirman la especificidad de los hallazgos del plasma de convalecientes y sugieren que las mutaciones observadas están relacionadas con anticuerpos que se dirigen a regiones fuera del RBD. En particular, los virus que contienen picos (ΔH69/ΔV70) mostraron una sensibilidad de neutralización reducida al anticuerpo monoclonal COVA1-21, dirigido a un epítopo aún no definido fuera del RBD10.

Para comprender cómo el pico (ΔH69/ΔV70) y el pico (D796H) podrían conferir resistencia a los anticuerpos, evaluamos cómo estas mutaciones podrían afectar la estructura del pico (Datos ampliados, figura 9). Basamos este análisis principalmente en una estructura que carecía de modificaciones estabilizadoras (PDB 6XR8)11, pero también nos referimos a estructuras estabilizadas determinadas a diferentes valores de pH12. ΔH69/ΔV70 está ubicado en un bucle glicosilado desordenado en la superficie distal del NTD, cerca del sitio de unión de los anticuerpos policlonales derivados del plasma de COV5713,14 (Datos ampliados, figura 9). Como este bucle es flexible y muy accesible, ΔH69/ΔV70 podría, en principio, afectar la unión de anticuerpos en esta región. D796 está ubicado cerca de la base de la proteína de pico, en un bucle de superficie que está estructuralmente desordenado en la conformación de prefusión y se convierte en parte de una gran región desordenada en el trímero S2 posfusión11 (Datos ampliados, figura 9). Se propone que el bucle que contiene el residuo 796 sea el objetivo de los anticuerpos15, a pesar de que las mutaciones en la posición 796 son relativamente poco comunes (Datos ampliados, figura 9). En las estructuras de púas descendentes de RBD11,12, D796 forma contactos con residuos en el protómero vecino, incluido el residuo glicosilado N709 (Datos ampliados, figura 9).

Aquí documentamos una respuesta evolutiva repetida del SARS-CoV-2 en presencia de terapia con anticuerpos durante el curso de una infección persistente en un huésped inmunodeprimido. La observación de una posible selección de variantes específicas que coinciden con la presencia de anticuerpos procedentes del plasma de convalecientes se ve respaldada por el hallazgo experimental de la doble susceptibilidad reducida de estos virus al plasma de convalecientes que contiene anticuerpos policlonales. En este caso, la aparición de la variante no fue la razón principal del fracaso del tratamiento.

Observamos en nuestro análisis signos de replicación viral compartimentada según las secuencias recuperadas en muestras del tracto respiratorio superior. Tanto los estudios genéticos de poblaciones como los de animales pequeños han demostrado una falta de recombinación entre los virus de la influenza dentro de un solo huésped durante una infección, lo que sugiere que la infección viral respiratoria aguda puede caracterizarse por poblaciones virales espacialmente distintas16,17. En el análisis de los datos, es importante distinguir los cambios genéticos que ocurren en la población viral primaria de los cambios aparentes que surgen de la observación estocástica de subpoblaciones espacialmente distintas en el huésped. Aunque las muestras que obtuvimos en los días 93 y 95 de la infección son genéticamente distintas de las otras muestras, las muestras restantes son consistentes con el surgimiento de una población viral consistente. Observamos que la detección de ARN viral en tejido post mortem se observó anteriormente no solo en tejido pulmonar, sino también en el bazo, el hígado y el corazón4. La mezcla de virus de diferentes compartimentos (por ejemplo, a través de la sangre o el movimiento de secreciones desde el tracto respiratorio inferior al superior) podría provocar fluctuaciones en las poblaciones virales en determinados sitios de muestreo.

Este es un informe de un caso único y, por lo tanto, se pueden extraer conclusiones limitadas sobre la generalización.

Una limitación importante es que los datos se derivaron de muestras del tracto respiratorio superior y no del tracto inferior, lo que limita las inferencias que se pueden hacer con respecto a las poblaciones virales en este único paciente.

Además de documentar la aparición del pico de SARS-CoV-2 (ΔH69/ΔV70) in vivo, mostramos que esta variante aumenta modestamente la infectividad de la proteína de pico en un ensayo de pseudotipado. La eliminación se observó simultáneamente con la rara variante S2 (D796H) después de dos ciclos separados de plasma convaleciente, con otras poblaciones virales emergiendo. D796H, pero no ΔH69/ΔV70, confirió una reducción en la susceptibilidad a los anticuerpos policlonales en las unidades de plasma convaleciente administradas, aunque no podemos especular sobre su efecto individual en sueros de otros individuos. Es notable que el doble mutante pico (D796H, ΔH69/ΔV70) disminuyó en prevalencia entre ciclos de plasma convaleciente, lo que sugiere que hubo otras fuerzas selectivas en juego en el período intermedio, que posiblemente estén impulsadas por la inflamación observada en el individuo. Esto incluye la posibilidad de que el haplotipo que comprende la espiga (D796H, ΔH69/ΔV70) haya portado mutaciones en otras regiones que fueron perjudiciales durante ese período intermedio. Aunque ΔH69/ΔV70 se está expandiendo a un ritmo elevado18, las mutaciones D796 también están aumentando. D796H se ha documentado en el 0,02 % de las secuencias globales y D796Y aparece en el 0,05 % de las secuencias globales (Datos ampliados, figura 9).

Es poco probable que los efectos del plasma convaleciente sobre la evolución del virus encontrados aquí se apliquen en huéspedes inmunocompetentes en quienes la diversidad viral probablemente sea menor debido a un mejor control inmunológico. Nuestros datos resaltan que es posible que sea necesario adaptar las medidas de control de infecciones a las necesidades de los pacientes inmunodeprimidos y también tener precaución en la interpretación de las directrices de los Centros de Control de Enfermedades de EE. UU. que recomiendan 20 días como límite superior de las precauciones de prevención de infecciones en pacientes inmunodeprimidos que están afebriles19. Debido a la dificultad de cultivar aislados clínicos, se justifica el uso de experimentos sustitutos20. Sin embargo, en los casos en los que es posible detectar una evolución viral en curso, esto sirve como un indicador claro de la existencia de un virus infeccioso. En nuestro caso, detectamos contaminación ambiental mientras estábamos en una habitación de uso individual y el paciente fue trasladado a una sala de aislamiento de enfermedades infecciosas con alto intercambio de aire y presión negativa.

La eficacia clínica del plasma convaleciente en pacientes con COVID-19 grave no ha sido demostrada21, y su uso en diferentes etapas de la infección y la enfermedad sigue siendo experimental; como tal, sugerimos que se reserve para su uso dentro de ensayos clínicos y con un seguimiento riguroso de los parámetros clínicos y virológicos. Los datos de este único paciente indican que se debe tener precaución con la terapia con plasma de convalecencia en pacientes con inmunosupresión tanto de células T como de células B; en estos pacientes, los anticuerpos administrados tienen poco apoyo de las células T citotóxicas, lo que reduce las posibilidades de eliminación y, en teoría, aumenta el potencial de evolución de mutaciones de escape en el SARS-CoV-2. Aunque estamos a la espera de más datos, en los casos en los que no es posible la inscripción en ensayos clínicos, lo ideal es que el plasma convaleciente administrado por necesidades clínicas en personas inmunodeprimidas solo se considere como parte de estudios observacionales, realizados preferiblemente en habitaciones de uso individual con mayores precauciones de control de infecciones. , incluido el muestreo ambiental de SARS-CoV-2 y la secuenciación en tiempo real. Comprender la dinámica viral y caracterizar la evolución viral en respuesta a diferentes presiones de selección en un individuo inmunodeprimido es necesario no sólo para mejorar el manejo del paciente sino también para beneficiar la salud pública.

Se recogieron muestras seriadas del paciente periódicamente del tracto respiratorio inferior (esputo o aspirado endotraqueal), del tracto respiratorio superior (garganta e hisopo nasal) y de las heces. La extracción de ácido nucleico se realizó a partir de 500 μl de muestra con una dilución de bacteriófago MS2 para que actuara como control interno, utilizando la plataforma easyMAG (Biomerieux) según las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se analizaron para detectar la presencia de SARS-CoV-2 con un ensayo RT-qPCR de un solo paso validado desarrollado en conjunto con Public Health England Clinical Microbiology22. Todas las reacciones de amplificación se realizaron en un instrumento de PCR Rotorgene. Se consideraron positivas las muestras con un valor de Ct ≤36.

Se utilizaron sueros de pacientes recuperados en el estudio COVIDx23 para probar la actividad de neutralización de los mutantes del SARS-CoV-2.

Las proteínas recombinantes de nucleocápside, pico y RBD del SARS-CoV-2 se acoplaron covalentemente a distintos conjuntos de cuentas carboxiladas (Luminex) para formar un triplex y se analizaron como se describió anteriormente24. La unión específica se informó como intensidades de fluorescencia medias.

La sangre entera se diluyó 1:5 en RPMI en placas F de 96 pocillos (Corning) y se activó mediante estimulación única con fitohemaglutinina (10 μg ml-1; Sigma-Aldrich), lipopolisacárido (1 μg ml-1, List Biochemicals) o mediante coestimulación con anticuerpos anti-CD3 (MEM57, Abcam, 200 ng ml-1, 1:1.000) e IL-2 (Immunotools, 1.430 U ml-1, 1:1.000). Los sobrenadantes se tomaron después de 24 h. Se muestran los niveles (pg ml-1) de IFNγ, IL-17, IL-2, TNF, IL-6, IL-1b e IL-10. Las citocinas se midieron mediante citometría de flujo basada en partículas multiplexadas en un analizador Luminex (Bio-Plex, Bio-Rad) utilizando un kit personalizado de R&D Systems (R&D Systems).

Para la secuenciación genómica viral, se extrajo el ARN total de las muestras como se describió anteriormente25. Las muestras se secuenciaron utilizando celdas de flujo MinION v.9.4.1 (Oxford Nanopore Technologies) siguiendo el protocolo ARTICnetwork v.326 y los archivos BAM se ensamblaron utilizando el proceso de ensamblaje ARTICnetwork27. Se seleccionó y también se secuenció un conjunto representativo de 10 secuencias utilizando la plataforma Illumina MiSeq. Los amplicones se diluyeron a 2 ng μl-1 y se utilizaron 25 μl (50 ng) como entrada para cada reacción de preparación de la biblioteca. La preparación de la biblioteca utilizó el kit KAPA Hyper Prep (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los amplicones fueron reparados en sus extremos y se les añadió un saliente A; Luego se ligaron con 15 mM de códigos de barras de ADN NEXTflex (Bio Scientific). Los productos posteriores a la ligadura se limpiaron con perlas AMPure y se eluyeron en 25 µl. Luego, se usaron 20 µl para la amplificación de la biblioteca mediante 5 ciclos de PCR. Para los controles negativos, se usó 1 ng para la preparación de la biblioteca basada en ligación. Todas las bibliotecas se analizaron utilizando TapeStation (Agilent Technologies) para evaluar el tamaño de los fragmentos y se cuantificaron mediante qPCR. Luego, todas las bibliotecas se agruparon en proporciones equimolares en consecuencia. Las bibliotecas se cargaron a 15 nM y se agregaron PhiX al 5 % (Illumina) y se secuenciaron para el ciclo MiSeq 500 utilizando un Miseq Nano v.2 con secuenciación de extremos emparejados de 2 × 250 pb. Se requería un mínimo de diez lecturas para una llamada de variante.

Para la secuenciación de lectura larga, los genomas se ensamblaron con ensamblaje basado en referencias y un proceso bioinformático curado con una cobertura mínima de 20 veces en todo el genoma27. Para la secuenciación de lecturas cortas, se descargaron archivos FASTQ, se identificaron y eliminaron lecturas de mala calidad, y se eliminaron los adaptadores Illumina y PHiX utilizando TrimGalore v.0.6.628. Las lecturas recortadas de extremos emparejados se asignaron a la secuencia de referencia MN908947.3 del Centro Nacional de Información Biotecnológica SARS-CoV-2 utilizando MiniMap2-2.17 con argumentos -ax y sr29. Luego, los archivos BAM se ordenaron e indexaron con Samtools v.1.11 y los duplicados ópticos de PCR se eliminaron usando Picard (//broadinstitute.github.io/picard). Se generaron secuencias de consenso de ácidos nucleicos con una cobertura mínima de todo el genoma de al menos 20 × con BCFtools utilizando un umbral de mayoría del 0%.

Las frecuencias variantes se validaron utilizando un código personalizado como parte del paquete AnCovMulti (https://github.com/PollockLaboratory/AnCovMulti). La idea principal detrás de esta validación era identificar y eliminar posibles errores de amplificación y mutabilidad consistentes cerca del final de las lecturas de Illumina. Además, se aplicó un filtrado estricto para eliminar la amplificación sesgada de mutaciones tempranas inducidas en laboratorio o variaciones de copia muy bajas.

El filtrado consistió en requerir un inicio exacto en un cebador dentro de los 2 pb del inicio de una lectura, una longitud mínima de lectura de 247 pb, menos de cuatro sitios bien separados divergentes de la secuencia de referencia, un tamaño de inserción máximo de tres nucleótidos, un máximo de tamaño de eliminación de 11 pb y resolución de señales conflictivas de diferentes cebadores.

Los extractos de ARN viral se transcribieron de forma inversa de cada muestra para capturar suficientemente la diversidad de la población viral sin introducir un sesgo de remuestreo. Se utilizaron SuperScript IV (Thermo Fisher Scientific) y cebadores específicos de genes para la transcripción inversa. El ARN molde se degradó con RNasa H (Thermo Fisher Scientific). Todos los cebadores utilizados fueron cebadores "internos" diseñados utilizando la alineación de secuencias múltiples de las secuencias consenso del paciente obtenidas mediante secuenciación de próxima generación. Se amplificó una secuencia genética parcial de pico (que codifica los aminoácidos 21 a 800) como una longitud continua de ADN (el gen de pico tiene aproximadamente 1,8 kb) mediante PCR anidada. El ADNc diluido terminalmente se amplificó mediante PCR utilizando ADN polimerasa Platinum Taq de alta fidelidad (Invitrogen) de modo que el 30 % de las reacciones fueron positivas30. Según las estadísticas de Poisson, se consideró que las secuencias tenían una probabilidad ≥80% de derivar de genomas únicos del VIH-1. Obtuvimos entre 20 y 60 genomas individuales en cada momento de la muestra para lograr un 90% de confianza en la detección de variantes presentes en ≥8% de la población viral in vivo31,32. Los amplicones de picos parciales obtenidos de la amplificación por PCR con dilución terminal se secuenciaron mediante Sanger para formar una secuencia contigua utilizando otro conjunto de ocho cebadores internos. Genewiz proporcionó la secuenciación de Sanger y la edición de secuencia manual se realizó utilizando el software DNA Dynamo (Blue Tractor Software).

Todas las secuencias del genoma completo del SARS-CoV-2 disponibles se descargaron de la base de datos GISAID (http://gisaid.org/)33 el 16 de diciembre de 2020. Se eliminaron las secuencias duplicadas y de baja calidad (>5 % de las regiones de la nucleocápside), dejando un conjunto de datos de 212.297 secuencias con una longitud de más de 29.000 pb. Todas las secuencias se ordenaron por nombre y solo se conservaron las secuencias secuenciadas con identificadores del Reino Unido/Inglaterra. A partir de este conjunto de datos, se deduplicaron secuencias y, en figuras en las que se requerían secuencias de fondo, se submuestrearon aleatoriamente utilizando seqtk (https://github.com/lh3/seqtk). Todas las secuencias se alinearon con la cepa de referencia MN908947.3 del SARS-CoV-2, utilizando MAFFT v.7.475 con selección automática de sabor34. Se asignaron las principales membresías del clado del SARS-CoV-2 a todas las secuencias utilizando el servidor Nextclade v.0.9 (https://clades.nextstrain.org/) y la asignación filogenética de linajes de brotes globales nombrados (PANGOLIN)35.

Se produjeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad utilizando el conjunto de datos curado anteriormente utilizando IQ-TREE v.2.1.236. La selección del modelo evolutivo para los árboles se infirió utilizando ModelFinder37 y los árboles se estimaron utilizando el modelo GTR + F + I con 1000 réplicas de arranque ultrarrápido38. Todos los árboles se visualizaron con Figtree v.1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/), basado en la secuencia de referencia del SARS-CoV-2 y los nodos dispuestos en orden descendente. Los nodos con valores de arranque inferiores a 50 se colapsaron mediante un script interno.

Se utilizó el paquete SAMFIRE v.1.0639 para llamar trayectorias de frecuencia de alelos a partir de datos de archivos BAM. Las lecturas se incluyeron en este análisis si tenían una puntuación PHRED mediana de al menos 30, recortando los extremos de las lecturas para lograrlo si era necesario. Luego se filtraron los nucleótidos para que tuvieran una puntuación PHRED de al menos 30; las lecturas con menos de 30 lecturas se descartaron. Las distancias entre secuencias, que representan información variante de baja frecuencia, también se obtuvieron utilizando SAMFIRE. La métrica de distancia de secuencia, descrita en un artículo anterior40, combina frecuencias alélicas en todo el genoma. Donde L es la longitud del genoma, definimos q(t) como un vector de elementos 4 × L que describe las frecuencias de cada uno de los nucleótidos A, C, G y T en cada locus del genoma viral muestreado en el momento t. Para cualquier locus i dado en el genoma, calculamos el cambio en las frecuencias alélicas entre los tiempos t1 y t2 mediante una generalización de la distancia de Hamming.

donde las líneas verticales indican el valor absoluto de la diferencia. Luego, estas estadísticas se combinaron en todo el genoma para generar la métrica de distancia de secuencia por pares.

Se utilizó el paquete de software Mathematica para realizar un análisis de regresión de distancias de secuencia por pares frente al tiempo, lo que condujo a una estimación de una tasa media de evolución de secuencia dentro del huésped. En contraste con el análisis filogenético, este enfoque asumió que las muestras recolectadas en los días 93 y 95 surgieron mediante emisión estocástica de una subpoblación espacialmente separada dentro del huésped, lo que llevó a una tasa inferida más baja de evolución viral para la mayor parte de la población viral.

Todas las variantes fueron validadas de manera indecente usando código personalizado como parte del paquete AnCovMulti (https://github.com/PollockLaboratory/AnCovMulti).

Las células se transfectaron con las preparaciones de plásmidos indicadas y 48 h después de la transfección, se recogió el sobrenadante del cultivo y se pasó a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 μm para eliminar los restos celulares. El filtrado se centrifugó a 15.000 rpm durante 120 minutos para sedimentar los viriones. Los viriones sedimentados se lisaron en tampón reductor Laemmli (Tris-HCl 1 M (pH 6,8), SDS, glicerol al 100 %, β-mercaptoetanol y azul de bromofenol). Los viriones granulados se sometieron a electroforesis en geles de proteína SDS 4–12% Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific) en condiciones reductoras. A esto le siguió la electrotransferencia sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las proteínas de pico del SARS-CoV-2 se visualizaron utilizando un sistema de imágenes ChemiDoc MP (Biorad) utilizando anticuerpos anti-spike S2 ​​(Invitrogen; dilución 1:1000) y anti-p24 Gag (reactivos para el SIDA de los NIH; dilución 1:1000).

Todas las secuencias se probaron para detectar una posible recombinación, ya que esto afectaría las estimaciones evolutivas. Se exploraron posibles eventos de recombinación con nueve algoritmos (RDP, MaxChi, SisScan, GeneConv, Bootscan, PhylPro, Chimera, LARD y 3SEQ), implementados en RDP5 con la configuración predeterminada41. Para corroborar cualquier hallazgo, también se utilizó ClonalFrameML v.1.1242 para inferir puntos de corte de recombinación. Ninguno de los programas encontró evidencia de recombinación en nuestros datos.

Se utilizó el sistema de gráficos moleculares PyMOL v.2.4.0 (https://github.com/schrodinger/pymol-open-source/releases) para mapear la ubicación de las cuatro mutaciones de pico de interés en un SARS-CoV-publicado previamente. Estructura de 2 púas (PDB: 6ZGE)43.

El ensayo ELISA (IgG) anti-SARS-CoV-2 utilizado para analizar el plasma de convalecientes en busca de títulos de anticuerpos fue Euroimmun Medizinische Labordiagnostika. Este ensayo indirecto basado en ELISA utiliza una proteína estructural recombinante de pico 1 (S1) del SARS-CoV-2 expresada en la línea celular humana HEK293 para la detección de IgG del SARS-CoV-2.

Las sustituciones de aminoácidos se introdujeron en el plásmido D614G pCDNA_SARS-CoV-2_Spike como se describió anteriormente44 utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightening, siguiendo las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies).

Los vectores virales se prepararon mediante transfección de células HEK293T utilizando el reactivo de transfección Fugene HD (Promega). Las células HEK293T se transfectaron con una mezcla de 11 µl de Fugene HD, 1 µg de pCDNAΔ19Spike–HA, 1 µg de vector de expresión p8.91 VIH-1 gag–pol45,46 y 1,5 µg de pCSFLW (que expresa el gen informador de luciferasa de luciérnaga con la señal de empaquetado del VIH-1). El sobrenadante viral se recogió a las 48 y 72 h después de la transfección, se filtró a través de un filtro de 0,45 μm y se almacenó a -80 °C. La dosis infecciosa del 50% en cultivo de tejidos (TCID50) del pseudovirus SARS-CoV-2 se determinó utilizando el sistema de ensayo Steady-Glo Luciferase (Promega).

La actividad transcriptasa inversa de las preparaciones de virus se determinó mediante qPCR utilizando un ensayo de PCR mejorado con producto basado en SYBR-Green como se describió anteriormente47. En resumen, se lisaron diluciones diez veces mayores del sobrenadante de virus en una proporción de 1:1 en una solución de lisis 2X (compuesta por 40% de glicerol (v/v), 0,25% de Triton X-100 (v/v), 100 mM de KCl. , inhibidor de RNasa 0,8 U ml-1, Tris HCL 100 mM, tamponado a pH 7,4) durante 10 min a temperatura ambiente.

Luego, se agregaron 12 µl de cada lisado de muestra a 13 µl de una mezcla maestra SYBR Green (que contenía 0,5 µM de cebadores directos e inversos de ARN MS2, 3,5 pmol ml-1 de ARN MS2 y 0,125 U µl-1 de inhibidor de RNasa Ribolock y Las cantidades relativas de actividad de transcriptasa inversa se determinaron como la tasa de transcripción del ARN del bacteriófago MS2, y la actividad de transcriptasa inversa absoluta se calculó comparando las cantidades relativas de transcripción inversa con un estándar de transcriptasa inversa de actividad conocida.

Se ha demostrado que los ensayos de pseudotipo de pico tienen características similares a las pruebas de neutralización que utilizan SARS-CoV-28 de tipo salvaje totalmente infeccioso. Se realizaron ensayos de neutralización de virus en células HEK293T transfectadas transitoriamente con ACE2 y TMPRSS2 utilizando el virus pseudotipado de pico de SARS-CoV-2 que expresa luciferasa48. El virus pseudotipado se incubó con diluciones seriadas de muestras de suero humano inactivado por calor o plasma de convaleciente por duplicado durante 1 hora a 37 °C. También se incluyeron controles de virus y células únicamente. Luego, se agregaron a cada pocillo células HEK293T que expresan ACE2 y TMPRSS2 recién tripsinizadas. Después de 48 h de incubación en un ambiente con 5% de CO2 a 37 °C, se midió la luminiscencia utilizando el sistema de ensayo Steady-Glo Luciferase (Promega).

Los ensayos de neutralización de virus se realizaron utilizando células HeLa que expresaban establemente ACE2 y utilizando virus pseudotipificados de picos de SARS-CoV-2 que expresaban luciferasa como se describió anteriormente49. El virus pseudotipado se incubó con diluciones seriadas de anticuerpos monoclonales purificados9 por duplicado durante 1 h a 37 °C. Luego, se agregaron a cada pocillo células recién tripsinizadas que expresan HeLa ACE2. Después de 48 h de incubación en un ambiente con 5% de CO2 a 37 °C, se midió la luminiscencia utilizando un sistema de ensayo Bright-Glo Luciferase (Promega) y se calculó la neutralización en relación con los controles solo de virus. Los valores de IC50 se calcularon en GraphPad Prism.

El estudio fue aprobado por el Comité Central de Ética en Investigación del Este de Inglaterra-Cambridge (17/EE/0025). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito tanto del paciente como de su familia. Se inscribieron pacientes de control adicionales con COVID-19 en el NIHR BioResource Center Cambridge bajo la aprobación de la junta de revisión ética (17/EE/0025).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este documento.

Los datos de secuenciación de lectura larga que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en la base de datos NCBI SRA con los códigos de acceso SAMN16976824–SAMN16976846 bajo BioProject PRJNA682013. Las lecturas breves y los datos utilizados para construir figuras se depositaron en https://github.com/Steven-Kemp/sequence_files. Todos los datos también están disponibles del autor correspondiente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El paquete SAMFIRE v.1.06 se utilizó para filtrar y llamar variantes a partir de los datos de Illumina. Está disponible en https://github.com/cjri/samfire/ para su revisión. Se utilizó código adicional para validar las frecuencias de las variantes y se puede encontrar en https://github.com/PollockLaboratory/AnCovMulti.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05104-2

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Agradecemos al paciente y su familia. Agradecemos al personal de CUH y al NIHR Cambridge Clinical Research Facility; R. Kugathasan y W. Barclay por las discusiones; M. Curran, W. Hamilton y D. Sparkes, A. Floto y F. Gallagher; J. Voss por el regalo de células HeLa que expresan establemente ACE2; y J. Nathan para la proteína RBD y L. James para la proteína de la nucleocápside. COG-UK cuenta con el apoyo de fondos del Consejo de Investigación Médica (MRC), parte de Investigación e Innovación del Reino Unido (UKRI), el Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR) y Genome Research Limited, que opera como el Instituto Wellcome Sanger. RKG cuenta con el respaldo de una beca senior en ciencias clínicas de Wellcome Trust (WT108082AIA). LEM cuenta con el apoyo del Premio al Desarrollo Profesional del Consejo de Investigación Médica (MR/R008698/1). SAK cuenta con el apoyo de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de la subvención PANGEA (OPP1175094). DAC cuenta con el apoyo de una beca de investigación de doctorado clínico de Wellcome Trust. CJRI reconoce la financiación del MRC (MC_UU_00002/11). Esta investigación fue apoyada por el Centro de Investigación Biomédica de Cambridge del Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR), la Unidad de Ensayos Clínicos de Cambridge (CCTU) y por el Fondo de Respuesta al Coronavirus de la UCL y fue posible gracias a generosas donaciones de los partidarios, ex alumnos y amigos de la UCL (para LEM). JAGB cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación Médica (MC_UP_1201/16). IGG es miembro senior de Wellcome y cuenta con el apoyo de Wellcome Trust (207498/Z/17/Z). DDP cuenta con el respaldo de NIH GM083127.

Estos autores contribuyeron igualmente: Steven A. Kemp, Dami A. Collier, Rawlings P. Datir

División de Infección e Inmunidad, University College London, Londres, Reino Unido

Steven A. Kemp, Dami A. Collier, Chloe Rees-Spear, Richard A. Goldstein y Laura E. McCoy

Instituto de Inmunología Terapéutica y Enfermedades Infecciosas de Cambridge (CITIID), Cambridge, Reino Unido

Dami A. Collier, Rawlings P. Datir, Isabella ATM Ferreira, Petra Mlcochova, Anita Chandra, Stephen Baker, Gordon Dougan, Christoph Hess, Paul J. Lehner, Paul A. Lyons, Nicholas J. Matheson, James ED Thaventhiran, Michael P .Weekes, Ben Bullman, Kelvin Hunter, Federica Mescia, Nicole Pond, Laura Bergamaschi, Ariana Betancourt, Georgie Bower, Chiara Cossetti, Madeline Epping, Andrew Hinch, Veronica Romashova, Lori Turner, Yorgo Modis, Kendra E. Leigh, Kenneth GC Smith y Ravindra K. Gupta

Departamento de Medicina, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Dami A. Collier, Rawlings P. Datir, Isabella ATM Ferreira, Petra Mlcochova, Anita Chandra, Stephen Baker, Gordon Dougan, Christoph Hess, Paul J. Lehner, Paul A. Lyons, Nicholas J. Matheson, Charlotte Summers, James ED Thaventhiran , Mark Toshner, Benjamin J. Dunmore, Stefan Gräf, Josh Hodgson, Christopher Huang, Kelvin Hunter, Ekaterina Legchenko, Cecilia Matara, Jennifer Martin, Federica Mescia, Ciara O'Donnell, Linda Pointon, Nicole Pond, Joy Shih, Rachel Sutcliffe, Tobias Tilly, Carmen Treacy, Zhen Tong, Jennifer Wood, Laura Bergamaschi, Ariana Betancourt, Georgie Bower, Chiara Cossetti, Aloka De Sa, Madeline Epping, Andrew Hinch, Sarah Jackson, Isobel Jarvis, Daniel Lewis, Joe Marsden, Georgina Okecha, Ommar Omarjee, Marianne Perera, Nathan Richoz, Veronika Romashova, Natalia Savinykh Yarkoni, Rahul Sharma, Lori Turner, Eckart MDD De Bie, Katherine Bunclark, Michael Mackay, Mayurun Selvan, M. Estee Torok, Elizabeth Blane, Yorgo Modis, Kendra E. Leigh , Kenneth GC Smith, John R. Bradley y Ravindra K. Gupta

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Fundación de Hospitales NHS de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Salma Gayed, Katherine Sharrocks, Jordan P. Skittrall, Theodore Gouliouris y Effrossyni Gkrania-Klotsas

Departamento de Patología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Aminu Jahun, Myra Hosmillo, Anna Smielewska e Ian G. Goodfellow

NHS Blood and Transplant, Tema de hematología de Oxford y BRC, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Ines Ushiro Lumb & David J. Roberts

Unidad de Pseudotipo Viral, Facultad de Farmacia Medway, Universidad de Kent, Canterbury, Reino Unido

Nigel Temperton

Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica, Cambridge, Reino Unido

George Modis, Kendra E. Leigh y John AG Briggs

Departamento de Microbiología Médica, Centro Médico Académico, Universidad de Ámsterdam, Ámsterdam, Países Bajos

Marit J. van Gils

NIHR Cambridge Bioresource, Cambridge, Reino Unido

Juan R. Bradley

Departamento de Virología, Fundación de Hospitales NHS de la Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Chris Smith y Anna Smielewska

Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Rainer Doffinger, Lourdes Cerón-Gutiérrez y Gabriela Bárcenas-Morales

FES-Cuautitlán, UNAM, Cuautitlán Izcalli, Mexico

Gabriela Barcenas-Morales

Bioquímica y Genética Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado, Aurora, CO, EE. UU.

Sarah Spencer y David D. Pollock

Departamento de Matemáticas Aplicadas y Física Teórica, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Nathalie Kingston, Stefan Gräf, John Allison, Helen Butcher, Daniela Caputo, Debbie Clapham-Riley, Eleanor Dewhurst, Anita Furlong, Barbara Graves, Jennifer Gray, Tasmin Ivers, Mary Kasanicki, Emma Le Gresley, Rachel Linger, Sarah Meloy, Francesca Muldoon , Nigel Ovington, Sofia Papadia, Isabel Phelan, Hannah Stark, Kathleen E. Stirrups, Paul Townsend, Neil Walker, Jennifer Webster, Jordan P. Skittrall y Christopher JR Illingworth

Laboratorio de Microbiología Clínica y Salud Pública, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Jordan P. Shittall

Unidad de Bioestadística del MRC, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Chris Jackson y Christopher J.R. Illingworth

Instituto Africano de Investigaciones en Salud, Durban, Sudáfrica

Ravindra K. Gupta

Departamento de Biomedicina, Universidad y Hospital Universitario de Basilea, Basilea, Suiza

Cristopher Hess

Centro de Investigación Botnar para la Salud Infantil (BRCCH) Universidad de Basilea y ETH Zurich, Basilea, Suiza

Cristopher Hess

Departamento de Hematología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Nathalie Kingston, Willem H. Owehand, Stefan Gräf, Nick Gleadall, Luca Stefanucci, Jonathan Stephens, John Allison, Nigel Ovington, Kathleen E. Stirrups, Paul Townsend y Neil Walker

Centro de Investigación Clínica de Cambridge, Centro de Investigación Clínica NIHR, Fundación NHS de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Caroline Saunders, Charlotte Summers, Ashlea Bucke, Jo Calder, Laura Canna, Jason Domingo, Anne Elmer, Stewart Fuller, Sarah Hewitt, Jane Kennet, Sherly Jose, Jenny Kourampa, Anne Meadows, Jane Price, Cherry Publico, Rebecca Rastall, Carla Ribeiro , Jane Rowlands, Valentina Ruffolo, Hugo Tordesillas, Petra Polgarova, Giovanni di Stefano y Mary Kasanicki

Instituto de Investigación del Corazón y los Pulmones, Cambridge, Reino Unido

Charlotte veranos y marca toshner

Royal Papworth Hospital NHS Foundation Trust, Cambridge, Reino Unido

Charlotte Summers, Mark Toshner, Ali Ansaripour, Alice Michael, Lucy Mwaura, Caroline Patterson y Gary Polwarth

Unidad de Toxicología del MRC, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

James ED Thaventhiran

Departamento de Pediatría, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Julie Harris y Criona O'Brien

Instituto de Investigación Médica de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Stuart Fawke

Departamento de Medicina Veterinaria, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Emma Jones

Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Marta Wylot

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital de Maternidad Rosie, Cambridge, Reino Unido

Stuart Fawke y Oisin Huhn

Cancer Research UK, Instituto de Cambridge, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Richard Grenfell y Mateusz Strezlecki

Laboratorio de Diagnóstico Molecular del Cáncer, Departamento de Oncología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

agradable francesca

Laboratorios de Investigación Metabólica, Instituto de Ciencias Metabólicas del Wellcome Trust-Medical Research Council, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Masa Josipovic

Departamento de Cirugía, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Sabrina Rossi y Cissy Yong

Cambridge and Peterborough Foundation Trust, Fulbourn Hospital, Fulbourn, Cambridge, Reino Unido

Codie Fahey y Rachel Michel

Centro Nacional Australiano de Fenomas, Universidad de Murdoch, Murdoch, Australia Occidental, Australia

Se-How Bong

Centro de Medicina Molecular y Terapéutica Innovadora, Health Futures Institute, Universidad Murdoch, Perth, Australia Occidental, Australia

Jerome D. Coudert

Centro de Medicina Computacional y de Sistemas, Health Futures Institute, Universidad Murdoch, Perth, Australia Occidental, Australia

Elaine Holmes

Departamento de Salud Pública y Atención Primaria, Facultad de Medicina Clínica, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Helen Butcher, Daniela Caputo, Debbie Clapham-Riley, Eleanor Dewhurst, Anita Furlong, Barbara Graves, Jennifer Gray, Tasmin Ivers, Emma Le Gresley, Rachel Linger, Sarah Meloy, Francesca Muldoon, Sofia Papadia, Isabel Phelan, Hannah Stark y Jennifer Webster

Centro de Innovación Enzimática, Universidad de Portsmouth (PORT), Portsmouth, Reino Unido

Samuel C. Robson y Angela H. Beckett

Instituto de Microbiología e Infecciones, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Nicholas J. Loman, Sam Nicholls, Claire McMurray, Alan McNally, Joshua Quick, Radoslaw Poplawski, Joanne Stockton y Will Rowe

Departamento de Medicina, Universidad de Cardiff, Cardiff, Reino Unido

Thomas R. Connor, Anna Price, Joel Southgate, Christine Kitchen, Huw Gulliver, Ian Merrick, Martyn Guest, Robert Munn, Angela Marchbank, Trudy Workman, William Fuller y Catherine Bresner

Public Health Wales NHS Trust, Cardiff, Reino Unido

Thomas R. Connor, Sally Corden, Catherine Moore, Joanne Watkins, Matthew Bull, Nicole Pacchiarini, Simon Cottrell, Sara Rey, David Heyburn, Chris Williams, Malorie Perry, Noel Craine, Alec Birchley, Alexander Adams, Amy Plimmer, Bree Gatica- Wilcox, Caoimhe McKerr, Ember Hilvers, Hannah Jones, Hibo Asad, Jason Coombes, Johnathan M. Evans, Laia Fina, Lauren Gilbert, Lee Graham, Michelle Cronin, Sara Kumziene-Summerhayes, Sarah Taylor, Sophie Jones, Joel Southgate, Giri Shankar , Rachel Jones, Robin Howe, Alisha Davies, Elen De Lacy, Fatima Downing, Sue Edwards, Laura Gifford, Mari Morgan y Amy Gaskin

Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Tanya Golubchik, David Bonsall y Christophe Fraser

Departamento de Virología, King's College London, Londres, Reino Unido

Rocío T. Martínez Núñez & Themoula Charalampous

Departamento de Medicina, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Catherine Ludden, Ewan M. Harrison, Dinesh Aggarwal, Alessandro M. Carabelli, Michael H. Spencer Chapman, Chris Ruis, Sharon J. Peacock, Beth Blane, Sophia T. Girgis, Katherine L. Bellis, Nazreen F. Hadjirin, Leanne M Kermack, Michael R. Chapman, Sophie Palmer, Carol M. Churcher, Ellena Brooks, Kim S. Smith, Katerina Galai, Georgina M. McManus, Danielle Leek, Sushmita Sridhar, Sally Forrest, Claire Cormie, Harmeet K. Gill, Joana Dias, Ellen E. Higginson, Mailis Maes, Jamie Young, Elias Allara y Clare Pearson

Departamento de Genómica de Patógenos, Wellcome Sanger Institute, Londres, Reino Unido

Ian Johnston, David K. Jackson, Ewan M. Harrison, Sonia Goncalves, Rich Livett, Roberto Amato, Jeff Barrett, Dinesh Aggarwal, Cordelia F. Langford, John Sillitoe, Dominic Kwiatkowski, Mara Lawniczak, Alex Alderton, Inigo Martincorena, Andrew R Bassett, Cristina V. Ariani, Michael H. Spencer Chapman, Laura Letchford, Steve Palmer, Danni Weldon, Naomi R. Park, Karen Oliver, Steven Leonard, Jillian Durham, Robert Davies, Mathew A. Beale, Katherine L. Bellis, Matthew J. Dorman, Eleanor Drury, Leanne Kane, Sally Kay, Samantha McGuigan, Rachel Nelson, Liam Prestwood, Shavanthi Rajatileka, Robin J. Moll, Marina Gourtovaia, Gerry Tonkin-Hill, Kevin Lewis, Jaime M. Tovar-Corona, Keith James, Jon-Paul Keatley, John Danesh, Michael R. Chapman, Charlotte Beaver, Luke Foulser, Sushmita Sridhar, Dorota Jamrozy, Stephanie Lo, Minal Patel, Emma Betteridge, Ben W. Farr, Scott Goodwin, Michael A. Quail, Carol Scott, Lesley Shirley, Scott AJ Thurston, Diana Rajan, Iraad F. Bronner, Louise Aigrain, Nicholas M. Redshaw, Stefanie V. Lensing, Shane McCarthy, Alex Makunin, James Bonfield, Christoph Puethe, Andrew Whitwham y Jennifier Liddle

Departamento de Medicina, Universidad de Brighton, Brighton, Reino Unido

Colin P. Smith, Giselda Bucca y Andrew R. Hesketh

Departamento de Innovación en Genómica, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Ali R. Awan y Chloe L. Fisher

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Fundación NHS de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

M. Estee Torok y William L. Hamilton

Departamento de Microbiología, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Reino Unido

M. Estee Torok y William L. Hamilton

Departamento de Medicina, Hospital Universitario de Southampton NHS Foundation Trust, Southampton, Reino Unido

Kordo Saeed, Jacqui A. Prieto, Siona Silveira, Emanuela Pelosi, Eleri Wilson-Davies, Adhyana IK Mahanama, Buddhini Samaraweera y Sarah Jeremiah

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

Kordo Saeed

Departamento de Medicina, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

Jacqui A. Prieto

Departamento de Investigación de Diagnóstico e Infecciones Clínicas, St Thomas' Hospital y Kings College London, Londres, Reino Unido

Luke B. Snell y Amita Patel

Belfast Health & Social Care Trust, Belfast, Reino Unido

Derek J. Fairley, James P. McKenna y Tanya Curran

Departamento de Medicina, Queen's University Belfast, Belfast, Reino Unido

Derek J. Fairley, David A. Simpson, Declan T. Bradley, Zoltan Molnar, Thomas Thompson y Erwan Acheson

Departamento de Secuencia Profunda, Facultad de Ciencias de la Vida, Centro Médico de Queens, Universidad de Nottingham, Nottingham, Reino Unido

Matthew W. Loose, Nadine Holmes, Christopher Moore, Matthew Carlile, Victoria Wright, Fei Sang y Johnny Debebe

Fundación NHS de la Universidad de East Kent Hospitals, Canterbury, Reino Unido

Samuel Moisés y Hannah Lowe

Departamento de Medicina, Universidad de Kent, Canterbury, Reino Unido

Samuel Moisés

Centro de biotecnología en el entorno construido, Universidad de Northumbria, Newcastle upon Tyne, Reino Unido

Darren L. Smith, Matthew Bashton y Gregory R. Young

Departamento de Medicina, Universidad de Northumbria, Newcastle upon Tyne, Reino Unido

Darren L. Smith, Matthew Bashton, Andrew Nelson, Gregory R. Young, Clare M. McCann y Wen C. Yew

NU-OMICS, Universidad de Northumbria, Newcastle upon Tyne, Reino Unido

Darren L. Smith, Andrew Nelson y Clare M. McCann

Centro de Vigilancia de Patógenos Genómicos, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

David M. Aanensen, Anthony P. Underwood, Corin A. Yeats, Khalil Abudahab, Ben EW Taylor y Mirko Menegazzo

Laboratorio de Microbiología Clínica y Salud Pública, Salud Pública de Inglaterra, Cambridge, Reino Unido

Martín D. Curran y Surendra Parmar

Salud Pública de Inglaterra, Londres, Reino Unido

Dinesh Aggarwal, Husam Osman, Meera Chand, Sharon J. Peacock, Esther Robinson, Peter Muir, Ian B. Vipond, Andrew Bosworth, Hannah M. Pymont, Stephanie Hutchings, Alicia Thornton, Richard Myers, Ian Harrison, Chloe Bishop, Vicki Chalker , Richard Hopes, Nicholas W. Machin, Shazaad SY Ahmad, Angie Lackenby, Tamyo Mbisa, Steven Platt, Shahjahan Miah, David Bibby, Carmen Manso, Jonathan Hubb, Gavin Dabrera, Mary Ramsay, Daniel Bradshaw, Ulf Schaefer, Natalie Groves, Eileen Gallagher, David Lee, David Williams, Nicholas Ellaby, Hassan Hartman, Nikos Manesis, Vineet Patel, Juan Ledesma, Katherine A. Twohig, Elias Allara y Clare Pearson

MRC-Centro de Investigación de Virus de la Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido

James G. Shepherd, Emma C. Thomson, David L. Robertson, Kathy K. Li, Rajiv N. Shah, Natasha G. Jesudason, Ana da Silva Filipe, Igor Starinskij, Richard J. Orton, Joseph Hughes, Sreenu Vattipally, Joshua B. Singer, Patawee Asamaphan, Marc O. Niebel, Lily Tong, Alice Broos, Daniel Mair, Jenna Nichols, Stephen N. Carmichael, Kyriaki Nomikou, Elihu Aranday-Cortes, Natasha Johnson y Seema Nickbakhsh

Universidad de Sheffield, Sheffield, Reino Unido

Matthew D. Parker, Untilhan I. de Silva, Dennis Wang, Matthew Wyles, Danielle C. Groves, Peijun Zhang, Marta Gallis, Stavroula F. Louka, Benjamin B. Lindsey, Timothy M. Freeman, Nikki Smith, Alexander J. Keeley , David G. Partridge, Mohammad Raza, Cariad Evans, Kate Johnson, Adrienn Angyal, Luke R. Green, Paul J. Parsons, Rachel M. Tucker, Rebecca Brown y Max Whiteley

Portsmouth Hospitals University NHS Trust, Portsmouth, Reino Unido

Sharon Glaysher, Anoop J. Chauhan, Scott Elliott, Kelly Bicknell, Sarah Wyllie, Allyson Lloyd y Robert Impey

Facultad de Farmacia y Ciencias Biomédicas, Universidad de Portsmouth (PORT), Portsmouth, Reino Unido

Katie F. Loveson, Salman Goudarzi, Christopher Fearn, Kate Cook, Hannah Dent y Hannah Paul

NHS Lothian, Edimburgo, Reino Unido

Kate E. Templeton, Martin P. McHugh, Rebecca Dewar y Elizabeth Wastenge

Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Kate E. Templeton, Andrew Rambaut, Stefan Rooke, Áine O'Toole, Thomas Williams, Verity Hill, Carlos E. Balcazar, Michael D. Gallagher, Kathleen A. Williamson y Thomas D. Stanton

Departamento de Medicina, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Dominic Kwiatkowski

Instituto Quadram de Biociencias, Norwich, Reino Unido

Justin O'Grady, Andrew J. Page, Gemma L. Kay, Nabil-Fareed Alikhan, Alexander J. Trotter, Leonardo de Oliveira Martins, Alison E. Mather, Lizzie Meadows, David J. Baker, Steven Rudder, Alp Aydin y Thanh Le-Viet

Departamento de Medicina, Universidad de East Anglia, Norwich, Reino Unido

Justin O'Grady y Rose K. Davidson

Salud Pública de Escocia, Glasgow, Reino Unido

Matthew TG Holden, Sharif Shaaban y Seema Nickbakhsh

Hospital Heartlands, Birmingham, Reino Unido

Husam Osman, Esther Robinson, Andrew Bosworth y Li Xu-McCrae

Departamento de Medicina, Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, Reino Unido

Monique Andersson, Anita Justice, Timothy Peto, David Eyre y Derrick Crook

Departamento de Medicina, Hospitales Universitarios de Brighton y Sussex NHS Trust, Brighton, Reino Unido

Mohammed O. Hassan-Ibrahim, Cassandra S. Malone y Benjamin J. Cogger

Departamento de Medicina, Universidad de Warwick, Warwick, Reino Unido

Chrystala Constantinidou, Meera Unnikrishnan, Richard Stark, Sascha Ott, Laura Baxter, Mohammad T. Alam, Jeffrey KJ Cheng, Hannah E. Bridgewater, Lucy R. Frost, Grace Taylor-Joyce y Paul E. Brown

Departamento de Medicina, Universidad de Liverpool, Liverpool, Reino Unido

Alistair C. Darby, Julian A. Hiscox, Steve Paterson, Miren Iturriza-Gomara, Anita O. Lucaci, Sam T. Haldenby, Kathryn A. Jackson, Lance Turtle, Edith E. Vamos, Margaret Hughes, Lucille Rainbow, Richard Eccles, Charlotte Nelson, Mark Whitehead, Richard Gregory, Matthew Gemmell, Claudia Wierzbicki y Hermione J. Webster

Departamento de Medicina, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Erik M. Volz, Manon Ragonnet-Cronin, Fabricia F. Nascimento, David Jorgensen, Olivia Boyd, Lily Geidelberg, Aileen Rowan, Graham P. Taylor, Igor Siveroni y Rob Johnson

Departamento de Zoología, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Oliver G. Pybus, Louis du Plessis, Alex E. Zarebski, Jayna Raghwani, Moritz UG Kraemer, Stephen W. Attwood, Sarah Francois, Tetyana I. Vasylyeva, Navy Staircase Zamudio y Bernardo Gutiérrez

Fideicomiso de la Fundación NHS de los Hospitales de Newcastle, Newcastle, Reino Unido

Yusri Taha, Jennifer Collins, Gary Eltringham, Brendan AI Payne, Shirelle Burton-Fanning y Sheila Waugh

División de Virología, Departamento de Patología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Aminu S. Jahun, Myra Hosmillo, Grant Hall, Yasmin Chaudhry, Malte L. Pinckert e Iliana Georgana

Hospitales Universitarios de Coventry y Warwickshire, Coventry, Reino Unido

Sarojini Pandey, Dimitris Grammatopoulos, Lisa Berry y Katie Jones

Universidad de Exeter, Exeter, Reino Unido

Ben Temperton, Stephen L. Michell, Aaron R. Jeffries, Jane AH Masoli, Bridget A. Knight, Christopher R. Jones, Claire M. Bewshea, Sian Ellard, Michelle L. Michelsen, Joanna Warwick-Dugdale, Robin Manley, Audrey Farbos , James W. Harrison, Christine M. Sambles y David J. Studholme

University College de Londres, Londres, Reino Unido

Sunando Roy, Judith Breuer, Rachel J. Williams, Mark Christiansen, Charlotte A. Williams, John A. Hartley, Adam P. Westhorpe, Riaz Janno, Helen L. Lowe, Angeliki Karamani, Leah Ensell, Marius Cotic y Nadua Bayzid

Wellcome Center for Human Genetics, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Mariateresa de Cesare, John A. Todd, David Buck, Angie Green, Amy Trebes y George MacIntyre-Cockett

Junta de Salud de la Universidad Betsi Cadwaladr, Betsi Cadwaladr, Reino Unido

Helena Adams

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Portsmouth (PORT), Portsmouth, Reino Unido

Yann Bourgeois y Garry P. Scarlett

Facultad de Medicina de Warwick e Instituto de Diagnóstico de Precisión y Patología, UHCW NHS Trust, Warwick, Reino Unido

Dimitris Grammatopoulos

Centro de Investigación de Diagnóstico e Infecciones Clínicas, Departamento de Enfermedades Infecciosas, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Jonathan Edgeworth, Rahul Batra, Themoula Charalampous y Gaia Nebbia

Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Judith Breuer, Kathryn Ann Harris, Julianne Rose Brown, Nathaniel Storey, Divya Shah, Laura Atkinson y Jack CD Lee

Junta de Salud de la Universidad de Cardiff y Vale, Cardiff, Reino Unido

Michaela John, Sian Morgan, Joshua Maksimovic, Karla Spellman, Kathryn McCluggage, Robert Beer y Safiah Afifi

Laboratorio llave en mano, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Alan McNally, Angus Best, Benita Percival, Jeremy Mirza, Oliver Megram, Megan Mayhew, Liam Crawford, Fiona Ashcroft, Emma Moles-García y Nicola Cumley

Gloucestershire Hospitals NHS Foundation Trust, Gloucester, Reino Unido

Juan Boyes

Departamento de Microbiología, Wye Valley NHS Trust, Hereford, Reino Unido

Venkat Sivaprakasam, Fenella Halstead y Wendy Hogsden

Sandwell and West Birmingham NHS Trust, Birmingham, Reino Unido

Tranprit Salluja, Melisa Louise Fenton, Ashok Dadrah y Amanda Symmonds

Hospital Universitario de Norfolk y Norwich, Norwich, Reino Unido

Samir Dervisevic, Emma J. Meader, Rachael Stanley y Lindsay Coupland

Royal Devon and Exeter NHS Foundation Trust, Exeter, Reino Unido

Jane AH Masoli, Bridget A. Knight, Christopher R. Jones, Sian Ellard y Cressida Auckland

Barking, Havering y Redbridge University Hospitals NHS Trust, Barking, Reino Unido

Cherian Koshy y Amy Ash

Hospital Reina Isabel, Birmingham, Reino Unido

Anna Casey y Liz Ratcliffe

Departamento de Microbiología, Hospital General de Kettering, Kettering, Reino Unido

Thomas Davis, Sahar Eldirdiri y Anita Kenyon

Microbiología clínica, Hospitales Universitarios de Leicester NHS Trust, Leicester, Reino Unido

Christopher Holmes, Paul Bird, Thomas Helmer, Karlie Fallon y Julian Tang

Imperial College Hospitals NHS Trust, Londres, Reino Unido

Paul Anthony Randell, Alison Cox, Pinglawathee Madona, Alison Holmes, James Price, Siddharth Mookerjee y Frances Bolt

Patología del Noroeste de Londres, Londres, Reino Unido

Paul Anthony Randell, Alison Cox y Pinglawathee Madonna

Royal Free NHS Trust, Londres, Reino Unido

Tabitha W. Mahungu, Dianne Irish-Tavares, Tanzina Haque, Jennifer Hart y Eric Witele

South Tees Hospitals NHS Foundation Trust, Newcastle, Reino Unido

Steven Liggett, Paul Baker, Stephen Bonner y Sarah Essex

North Cumbria Integrated Care NHS Foundation Trust, Carlisle, Reino Unido

Clive Graham, Edward Barton, Debra Padgett y Garren Scott

North Tees y Hartlepool NHS Foundation Trust, Stockton-on-Tees, Reino Unido

Emma Swindells y Jane Greenaway

Fideicomiso de la Fundación NHS del Condado de Durham y Darlington, Durham, Reino Unido

Sharon Campbell, Veena Raviprakash, Nicola Sheriff, Victoria Blakey y Lesley-Anne Williams

Virología, Facultad de Ciencias de la Vida, Centro Médico de Queens, Universidad de Nottingham, Nottingham, Reino Unido

Patrick C. McClure, Joseph G. Chappell, Theocharis Tsoleridis y Jonathan Ball

Departamento de Microbiología Clínica, Queens Medical Centre, Nottingham, Reino Unido

Gemma Clark, Carl Jones, Wendy Smith, Manjinder Khakh, Vicki M. Fleming, Michelle M. Lister, Hannah C. Howson-Wells, Louise Berry, Tim Boswell, Amelia Joseph e Iona Willingham

PathLinks, Northern Lincolnshire & Goole NHS Foundation Trust, Scunthorpe, Reino Unido

Tim J. Sloan, Nichola Duckworth y Sarah Walsh

Hospital de Basingstoke, Basingstoke, Reino Unido

Jessica Lynch, Emma Wise, Nathan Moore, Matilde Mori, Nick Cortés y Stephen Kidd

Universidad de Surrey, Guildford, Reino Unido

Jessica Lynch, Emma Wise, Nathan Moore, Matilde Mori, Nick Cortés y Stephen Kidd

Fideicomiso de la Fundación NHS de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Ben Warne

Universidad de Swansea, Swansea, Reino Unido

Ronan A. Lyons

Ministerio de Salud, Colombo, Sri Lanka

Adhyana IK Mahanama y Buddhini Samaraweera

Cambridge Stem Cell Institute, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Nicola Reynolds y Michelle Wantoch

Laboratorios clínicos de Liverpool, Liverpool, Reino Unido

Jenifer Mason, Trevor I. Robinson, Elaine O'Toole, Joanne Watts, Cassie Breen y Angela Cowell

Unidad de Investigación de Protección de la Salud del NIHR en HCAI y AMR, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Alison Holmes, James Price, Siddharth Mookerjee y Frances Bolt

Investigación de datos de salud del Reino Unido Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Michael Chapman

Hampshire Hospitals NHS Foundation Trust, Winchester, Reino Unido

Gabrielle Vernet y Rebecca Williams

Agencia de Salud Pública, Londres, Reino Unido

Declan T. Bradley y Tim Wyatt

Departamento de Biología de Infecciones, Facultad de Enfermedades Infecciosas y Tropicales, Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, Londres, Reino Unido

Francesc Coll

Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Alex Richter y Andrew Beggs

Centro especializado en virología del oeste de Escocia, NHS Greater Glasgow and Clyde, Glasgow, Reino Unido

Rory N. Gunson

NHS Greater Glasgow y Clyde, Glasgow, Reino Unido

Amanda Bradley, Alasdair Maclean, Guy Mollett y Rachel Blacow

Servicio Nacional de Infecciones, PHE y Leeds Teaching Hospitals Trust, Leeds, Reino Unido

Antony D. Hale, Louissa R. Macfarlane-Smith, Katherine L. Harper y Holli Carden

Fundación NHS de la Universidad de Manchester, Manchester, Reino Unido

Nicholas W. Machin, Shazaad SY Ahmad y Ryan P. George

Hospitales Guy's y St Thomas', Londres, Reino Unido

Adela Alcolea-Medina

Viapath, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust y King's College Hospital NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Adela Alcolea-Medina, Alberto C. Cerda, Tammy V. Merrill y Rebekah E. Wilson

Laboratorios de servicios de salud, Londres, Reino Unido

Lisa J. Levett, Judith Heaney, Wendy Chatterton y Monika Pusok

Maidstone y Tunbridge Wells NHS Trust, Maidstone, Reino Unido

Graciela Sluga

Gateshead Health NHS Foundation Trust, Gateshead, Reino Unido

Jonathan Moore y Susanne Stonehouse

Consejo del condado de Norfolk, Norwich, Reino Unido

Luisa Smith

Fideicomiso de la Fundación NHS de East Suffolk y North Essex, Ipswich, Reino Unido

Lucas Bedford

Departamento de Medicina, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

matilda mori

Departamento de Microbiología, Hospital Princess Alexandra, Harlow, Reino Unido

Nick Levene y Lynn Monaghan

Hospitales universitarios de Sheffield, Sheffield, Reino Unido

David G. Partridge, Mohammad Raza, Cariad Evans y Kate Johnson

Instituto de Biodiversidad, Sanidad Animal y Medicina Comparada, Glasgow, Reino Unido

Katherine L. Smollett

Departamento de Enfermedades Infecciosas, King's College London, Londres, Reino Unido

Adrian W. Signell, Gilberto Betancor & Harry D. Wilson

BRC de Guy y St Thomas, Londres, Reino Unido

Flavia Flaviani

Universidad de Newcastle, Newcastle, Reino Unido

Steven Rushton y Sarah O'Brien

Centro Wellcome Sanger, Hinxton, Reino Unido

Irina Abnizova, Louise Aigrain, Alex Alderton, Mozam Ali, Laura Allen, Roberto Amato, Ralph Anderson, Cristina Ariani, Siobhan Austin-Guest, Sendu Bala, Jeffrey Barrett, Andrew Bassett, Kristina Battleday, James Beal, Mathew Beale, Charlotte Beaver, Sam Bellany, Tristram Bellerby, Katie Bellis, Duncan Berger, Matt Berriman, Emma Betteridge, Paul Bevan, Simon Binley, Jason Bishop, Kirsty Blackburn, James Bonfield, Nick Boughton, Sam Bowker, Timothy Brendler-Spaeth, Iraad Bronner, Tanya Brooklyn, Sarah Kay Buddenborg, Robert Bush, Catarina Caetano, Alex Cagan, Nicola Carter, Joanna Cartwright, Tiago Carvalho Monteiro, Liz Chapman, Tracey-Jane Chillingworth, Peter Clapham, Richard Clark, Adrian Clarke, Catriona Clarke, Daryl Cole, Elizabeth Cook, María Coppola, Linda Cornell, Clare Cornwell, Craig Corton, Abby Crackett, Alison Cranage, Harriet Craven, Sarah Craw, Mark Crawford, Tim Cutts, Monika Dabrowska, Matt Davies, Robert Davies, Joseph Dawson, Callum Day, Aiden Densem, Thomas Dibling, Cat Dockree, David Dodd, Sunil Dogga, Matthew Dorman, Gordon Dougan, Martin Dougherty, Alexander Dove, Lucy Drummond, Eleanor Drury, Monika Dudek, Jillian Durham, Laura Durrant, Elizabeth Easthope, Sabine Eckert, Pete Ellis, Ben Farr, Michael Fenton , Marcella Ferrero, Neil Flack, Howerd Fordham, Grace Forsythe, Luke Foulser, Matt Francis, Audrey Fraser, Adam Freeman, Anastasia Galvin, María García-Casado, Alex Gedny, Sophia Girgis, James Glover, Sonia Goncalves, Scott Goodwin, Oliver Gould , Marina Gourtovaia, Andy Gray, Emma Gray, Coline Griffiths, Yong Gu, Florence Guerin, Will Hamilton, Hannah Hanks, Ewan Harrison, Alexandria Harrott, Edward Harry, Julia Harvison, Paul Heath, Anastasia Hernandez-Koutoucheva, Rhiannon Hobbs, Dave Holland , Sarah Holmes, Gary Hornett, Nicholas Hough, Liz Huckle, Lena Hughes-Hallet, Adam Hunter, Stephen Inglis, Sameena Iqbal, Adam Jackson, David Jackson, Keith James, Dorota Jamrozy, Carlos Jiménez Verdejo, Ian Johnston, Matthew Jones, Kalyan Kallepally, Leanne Kane, Keely Kay, Sally Kay, Jon Keatley, Alan Keith, Alison King, Lucy Kitchin, Matt Kleanthous, Martina Klimekova, Petra Korlevic, Ksenia Krasheninnkova, Dominic Kwiatkowski, Greg Lane, Cordelia Langford, Adam Laverack, Katharine Law, Mara Lawniczak, Stefanie Lensing, Steven Leonard, Laura Letchford, Kevin Lewis, Amanah Lewis-Wade, Jennifer Liddle, Quan Lin, Sarah Lindsay, Sally Linsdell, Rich Livett, Stephanie Lo, Rhona Long, Jamie Lovell, Jon Lovell, Catherine Ludden, James Mack, Mark Maddison, Aleksei Makunin, Irfan Mamun, Jenny Mansfield, Neil Marriott, Matt Martin, Inigo Martincorena, Matthew Mayho, Shane McCarthy, Jo McClintock, Samantha McGuigan, Sandra McHugh, Liz McMinn, Carl Meadows, Emily Mobley, Robin Moll , Maria Morra, Leanne Morrow, Kathryn Murie, Sian Nash, Claire Nathwani, Plamena Naydenova, Alexandra Neaverson, Rachel Nelson, Ed Nerou, Jon Nicholson, Tabea Nimz, Guillaume G. Noell, Sarah O'Meara, Valeriu Ohan, Karen Oliver, Charles Olney, Doug Ormond, Agnes Oszlanczi, Steve Palmer, Yoke Fei Pang, Barbora Pardubska, Naomi Park, Aaron Parmar, Gaurang Patel, Minal Patel, Maggie Payne, Sharon Peacock, Arabella Petersen, Deborah Plowman, Tom Preston, Liam Prestwood, Christoph Puethe, Michael Quail, Diana Rajan, Shavanthi Rajatileka, Richard Rance, Suzannah Rawlings, Nicholas Redshaw, Joe Reynolds, Mark Reynolds, Simon Rice, Matt Richardson, Connor Roberts, Katrina Robinson, Melanie Robinson, David Robinson, Hazel Rogers, Eduardo Martin Rojo , Daljit Roopra, Mark Rose, Luke Rudd, Ramin Sadri, Nicholas Salmon, David Saul, Frank Schwach, Carol Scott, Phil Buscando, Lesley Shirley, John Sillitoe, Alison Simms, Matt Sinnott, Shanthi Sivadasan, Bart Siwek, Dale Sizer, Kenneth Skeldon, Jason Skelton, Joanna Slater-Tunstill, Lisa Sloper, Nathalie Smerdon, Chris Smith, Christen Smith, James Smith, Katie Smith, Michelle Smith, Sean Smith, Tina Smith, Leighton Sneade, Carmen Diaz Soria, Catarina Sousa, Emily Souster, Andrew Sparkes, Michael Spencer-Chapman, Janet Squares, Robert Stanley, Claire Steed, Tim Stickland, Ian Still, Mike Stratton, Michelle Strickland, Allen Swann, Agnieszka Swiatkowska, Neil Sycamore, Emma Swift, Edward Symons, Suzanne Szluha, Emma Taluy, Nunu Tao, Katy Taylor, Sam Taylor, Stacey Thompson, Mark Thompson, Mark Thomson, Nicholas Thomson, Scott Thurston, Gerry Tonkin-Hill, Dee Toombs, Benjamin Topping, Jaime Tovar-Corona, Daniel Ungureanu, James Uphill, Jana Urbanova, Philip Jansen Van, Valerie Vancollie, Paul Voak, Danielle Walker, Matthew Walker, Matt Waller, Gary Ward, Charlie Weatherhogg, Niki Webb, Danni Weldon, Alan Wells, Eloise Wells, Luke Westwood, Theo Whipp, Thomas Whiteley, Georgia Whitton, Andrew Whitwham , Sara Widaa, Mia Williams, Mark Wilson y Sean Wright

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RKG, SAK, DAC, AS, TG y EG-K. concibió el estudio. RKG, SAK, DAC, LEM, JAGB, EG-K., NT, A. Chandra, CS, RD, RAG, DDP e YM diseñaron experimentos. SAK, DAC, LEM, RD, CR-S., AJ, IATMF, KS, TG, CJRI, JRB, JPS, MJvG, LG-C., GB-M. y KL realizaron experimentos. RKG, SAK, DAC, PM, LEM, JAGB, SG, KS, TG, JB, KGCS, IGG, CJRI, IUL, DJR, JPS, JRB, RAG, DDP, RD, LC-G. y GB-M. datos interpretados. RKG, DAC y SAK escribieron el primer borrador del artículo. Todos los autores contribuyeron a la revisión del artículo.

Correspondencia a Ravindra K. Gupta.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información de revisión por pares Nature agradece a Richard Neher y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

CPAP: presión positiva continua en las vías respiratorias; CT, umbral del ciclo; UIT, unidad de terapia intensiva.

a, Los recuentos de glóbulos blancos (WCC) y linfocitos se expresan como 103 células por mm3. PCR, proteína C reactiva. b, Evaluación de las células T y función innata. Las citocinas se midieron en sangre total después de la estimulación durante 24 h, ya sea después de la estimulación de células T con fitohemaglutinina (PHA) o anticuerpos anti-CD3/IL2, o de estimulación innata con lipopolisacárido (LPS). Los datos de individuos de control sanos se muestran como círculos grises (n = 15), los datos del paciente X1 en los días 71 y 98 se muestran como círculos azules y rojos, respectivamente. Los niveles de citoquinas se muestran como pg ml-1. Los datos son media ± DE

Datos fuente

a, Anticuerpos IgG anti-SARS-CoV-2 en el paciente X1, antes y después del tratamiento con plasma de convalecencia (días 66 y 95) en comparación con pacientes RNA+ con COVID-19 e individuos de control sanos prepandémicos. Los anticuerpos IgG rojos, grises y dorados contra la proteína de la nucleocápside (N), la proteína de pico trimérico (S) y el RBD del SARS-CoV-2 se midieron mediante citometría de flujo basada en partículas multiplexadas (Luminex) en pacientes con ARN+ con COVID-19 ( n = 20, puntos rojos), individuos de control sanos prepandémicos (n = 20, puntos grises) y plasma de donantes convalecientes (puntos naranjas). Los sueros de los pacientes a lo largo del tiempo se muestran en azul: IgG anti-SARS-CoV-2 a la nucleocápside (cuadrados azules), pico (círculos azules) y RBD (triángulos azules). Los datos son intensidad fluorescente media (MFI) ± sd. También se muestra el momento de las unidades de plasma de convalecencia (días después de la primera prueba positiva). b, títulos de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 en plasma de convalecientes. Medición de títulos de anticuerpos IgG específicos del SARS-CoV-2 en tres unidades de plasma convaleciente mediante el ensayo Euroimmun. OD, densidad óptica.

Datos fuente

a, Comparación entre los métodos de secuenciación de una sola molécula de lectura corta (Illumina) y de lectura larga (Oxford Nanopore) para las seis mutaciones observadas en la proteína de pico. La concordancia fue generalmente buena entre la mayoría de los puntos temporales; sin embargo, debido a grandes discrepancias en varios puntos de tiempo, sugerimos que debido a la alta tasa de error de llamada de base, el método Nanopore aún no es adecuado para llamar a variantes minoritarias. Como tal, todas las figuras del artículo principal se produjeron utilizando únicamente los datos de Illumina. b, Datos de secuenciación de un solo genoma de muestras respiratorias en los días indicados. Se muestra el número de genomas individuales obtenidos en cada momento con las mutaciones de interés (identificadas mediante secuenciación profunda). *El denominador es 19, ya que las lecturas del cebador de dos muestras eran de mala calidad en el aminoácido 796 el día 98. Variante de aminoácido y posición de nucleótido correspondiente: pico (W64G), 21752; pico (Δ69), 21765–21770; pico (Y200H), 22160; pico (T240I), 22281; pico (P330S), 22550; pico(D795H), 23948.

Datos fuente

a, Distancias por pares entre muestras medidas utilizando la métrica de distancia de todos los lugares trazados frente a distancias por pares en el tiempo (medidas en días) entre las muestras que se recolectan. Las distancias internas entre las muestras del clado principal propuesto se muestran en negro, las distancias entre las muestras del clado principal y las muestras recolectadas en los días 93 y 95 se muestran en rojo, y las distancias internas entre las muestras recolectadas en los días 93 y 95 se muestran en verde. b, Distancias por pares entre muestras del clado más grande (negro) y entre estas muestras y las recolectadas en los días 93 y 95 (rojo). Los valores medianos de las distribuciones de estos valores son significativamente diferentes según una prueba U de Mann-Whitney. c, Distancias por pares entre muestras en el clado principal, una vez eliminados los datos recopilados en los días 86, 89, 93 y 95 (negro) y entre estas muestras y las recopiladas en los días 86 y 89 (rojo). Los valores medianos de las distribuciones de estos valores no son significativamente diferentes al nivel del 5% según una prueba U de Mann-Whitney.

a, Vista ampliada del árbol filogenético de máxima verosimilitud que muestra la diversidad del paciente X1 y otros tres pacientes que mostraron eliminación a largo plazo del SARS-CoV-2 del área local (rojo, azul y morado), en comparación con secuencias publicadas recientemente4 ,5 (naranja y dorado). Los pacientes de control con SARS-CoV-2 generalmente mostraron una diversidad temporal limitada, aunque las secuencias de uno de los estudios anteriores4 fueron muy divergentes. Se indican muestras ambientales (el timbre de llamada y el teléfono móvil del paciente). Las ramas de los árboles colapsaron donde el soporte de arranque era <60. b, Gráfico de resaltado que muestra los cambios de nucleótidos a nivel de consenso en muestras respiratorias secuenciales en comparación con la secuencia de consenso en el primer diagnóstico de COVID-19. Cada fila indica el momento en que se recopiló la muestra (número de días después del primer resultado positivo de RT-qPCR para SARS-CoV-2). Las líneas discontinuas negras indican la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) y las regiones de picos del genoma. Hubo pocas sustituciones de nucleótidos entre los días 1 y 54, a pesar de que el paciente recibió dos ciclos de remdesivir. Los primeros cambios importantes en el genoma de la espiga se produjeron el día 82, después de que se administrara plasma de convaleciente en los días 63 y 65. La eliminación de aminoácidos en S1 (ΔH69/ΔV70) se indica con las líneas negras. Los sitios de muestra incluyeron aspirado endotraqueal (ETA) e hisopos de nariz y garganta (N+T).

a, Infección de células HEK293T diana que expresan receptores TMPRSS2 y ACE2 utilizando cantidades iguales de virus según lo determinado por la actividad de la transcriptasa inversa. Los puntos de datos son media ± sem. de réplicas técnicas (n = 2); Los datos son representativos de n = 2 experimentos independientes. b, Gráficos de dilución inversa representativos para variantes de pico frente a las unidades de plasma convaleciente 1 a 3. Los datos son media ±sem de la neutralización de réplicas técnicas (n = 2). Los datos son representativos de dos experimentos independientes (n = 2).

Datos fuente

a, Los lentivirus pseudotipados con la proteína de pico (tipo salvaje (WT) (fondo D614G), D796H, ΔH69/ΔV70, D796H + ΔH69/ΔV70) del SARS-CoV-2 se produjeron en células HEK293T y se usaron para infectar células Hela diana de manera estable. expresando ACE2 en presencia de diluciones seriadas de los anticuerpos monoclonales (mAb) indicados. Los datos son media ± DE de n = 2 réplicas técnicas. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. b, Las clases de anticuerpos de unión a RBD y los cambios en las mutaciones de pico D796H o ΔH69/ΔV70 se indican en un estudio publicado previamente50. Los grupos II y V contienen únicamente anticuerpos monoclonales no neutralizantes; los grupos más pequeños de anticuerpos monoclonales neutralizantes IV (n = 2) y X (n = 1) no se analizaron. El rojo indica cambios significativos en los pliegues.

Datos fuente

a, El trímero de pico del SARS-CoV-2 (PDB ID: 6XR8) con dos protómeros representados como superficies y un protómero representado como una cinta. El NTD está coloreado en azul claro, el RBD en rosa claro, el péptido de fusión en rosa oscuro, el dominio HR1 en amarillo, el dominio CH en verde pálido y el dominio CD en marrón. La ubicación de D796 y H69 está indicada por esferas rojas. El bucle que conecta D796 con el péptido de fusión está coloreado en magenta para mejorar la visibilidad. Las líneas grises dobles proporcionan orientación con respecto a la membrana. b, Ampliación de la región definida por el cuadro alrededor de H69 en a. H69 está resaltado en amarillo. Los residuos que contienen átomos que se encuentran dentro de los 6 Å de H69 se resaltan en cian. c, Ampliación de la región definida por el cuadro alrededor de D796 en a. D796 está resaltado en amarillo. Los residuos que contienen átomos que se encuentran dentro de los 6 Å de D796 se resaltan en cian. Los enlaces de hidrógeno se indican con líneas discontinuas amarillas. Se han etiquetado los residuos hidrofóbicos en las proximidades de D796. Y707 es del protómero vecino. d, Prevalencia global de mutaciones de pico seleccionadas descritas en este artículo. Todas las secuencias de alta cobertura se descargaron de la base de datos GISAID el 6 de enero de 2021 y se alinearon mediante MAFFT; a esta fecha había 298.254 secuencias disponibles. La prevalencia global de cada una de las seis variantes de pico (W64G, ΔH69/ΔV70, Y200H, T240I, P330S y D796H) se evaluó viendo la alineación de secuencias múltiples en AliView, ordenando por la columna de interés y contando el número de mutaciones.

Una lista completa de miembros de la Colaboración CITIID-NIHR BioResource COVID-19.

Este archivo contiene detalles de casos clínicos complementarios, tablas complementarias 1-4 y figuras complementarias 1-2.

Reimpresiones y permisos

Kemp, SA, Collier, DA, Datir, RP et al. Evolución del SARS-CoV-2 durante el tratamiento de la infección crónica. Naturaleza 592, 277–282 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03291-y

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Recibido: 01 de diciembre de 2020

Aceptado: 26 de enero de 2021

Publicado: 05 de febrero de 2021

Fecha de emisión: 08 de abril de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03291-y

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