Sensibilidad del SARS

Nature volumen 593, páginas 136–141 (2021)Cite este artículo

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La transmisión del SARS-CoV-2 no está controlada en muchas partes del mundo; El control se ve agravado en algunas áreas por el mayor potencial de transmisión de la variante B.1.1.71, que ya se ha informado en 94 países. No está claro si la respuesta del virus a las vacunas contra el SARS-CoV-2 basada en la cepa prototípica se verá afectada por las mutaciones encontradas en B.1.1.7. Aquí evaluamos las respuestas inmunes de los individuos después de la vacunación con la vacuna basada en ARNm BNT162b22. Medimos las respuestas de los anticuerpos neutralizantes después de la primera y segunda inmunizaciones utilizando pseudovirus que expresaban la proteína de pico de tipo salvaje o una proteína de pico mutada que contenía los ocho cambios de aminoácidos encontrados en la variante B.1.1.7. Los sueros de personas que recibieron la vacuna mostraron una amplia gama de títulos neutralizantes contra los pseudovirus de tipo salvaje que se redujeron modestamente contra la variante B.1.1.7. Esta reducción también fue evidente en los sueros de algunos pacientes que se habían recuperado de la COVID-19. También se observó una disminución de la neutralización de la variante B.1.1.7 para los anticuerpos monoclonales que se dirigen al dominio N-terminal (9 de 10) y al motivo de unión al receptor (5 de 31), pero no para los anticuerpos monoclonales que reconocen la variante B.1.1.7. dominio de unión al receptor que se une fuera del motivo de unión al receptor. La introducción de la mutación que codifica la sustitución E484K en el fondo B.1.1.7 para reflejar una variante preocupante recientemente surgida (VOC 202102/02) condujo a una pérdida más sustancial de la actividad neutralizante de los anticuerpos monoclonales y los anticuerpos provocados por la vacuna ( 19 de 31) en comparación con la pérdida de actividad neutralizante conferida por las mutaciones en B.1.1.7 solas. La aparición de la sustitución E484K en un contexto B.1.1.7 representa una amenaza para la eficacia de la vacuna BNT162b2.

La vacuna de ARNm BNT162b2 codifica la proteína de pico trimerizada de longitud completa del SARS CoV-22 y fue diseñada contra el aislado de Wuhan-1. Han surgido preocupaciones sobre si las vacunas serán efectivas contra las variantes emergentes del SARS-CoV-2, como la B.1.1.7 (N501Y.V1)3. En estudios clínicos de BNT162b2, el título medio geométrico (GMT) de anticuerpos neutralizantes asociados con una neutralización del 50% aumentó después de la primera dosis y la vacuna proporcionó altos niveles de protección contra infecciones y enfermedades graves después de la segunda dosis4.

Los participantes (n = 37) recibieron la primera dosis de la vacuna de ARNm BNT162b2 3 semanas antes de que se les extrajera sangre para la recolección de células mononucleares de suero y sangre periférica. La mediana de edad fue de 62 años (rango intercuartil, 47 a 84 años) y el 35% de los participantes eran mujeres. De estos participantes, a 21 personas también se les extrajo sangre 3 semanas después de recibir la segunda dosis de la vacuna de ARNm BNT162b2. Se analizaron los títulos de IgG sérica contra la proteína de la nucleocápside, la proteína de pico y el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de pico (Datos ampliados, figura 1a).

Utilizando pseudotipado lentiviral, estudiamos las proteínas de pico de tipo salvaje (pico de tipo salvaje con D614G) y mutante B.1.1.7 (Fig. 1a) para medir la actividad de neutralización de los sueros obtenidos con la vacuna. Los sueros de la vacuna exhibieron una variedad de diluciones inhibidoras que proporcionaron una neutralización del 50% (ID50) (Fig. 1b, c). El GMT contra la proteína de pico de tipo salvaje después de la segunda dosis de la vacuna fue sustancialmente mayor que después de la primera dosis (318 en comparación con 77) (Fig. 1b, e). Hubo correlación entre los títulos totales de IgG pico y los títulos de neutralización sérica (Datos ampliados, figura 1b). IFNγ FluoroSpot midió una amplia gama de respuestas de células T contra los péptidos del SARS-CoV-2 en muestras de personas que recibieron la vacuna después de la primera dosis. Estas respuestas celulares no se correlacionaron con los títulos de neutralización sérica ni con los títulos de anticuerpos de pico IgG (Datos ampliados, figuras 1c, d).

a, Spike en la conformación abierta con un solo RBD erecto (Banco de datos de proteínas (PDB): 6ZGG) se muestra en la vista vertical del eje del trímero. Las ubicaciones de los residuos mutados se muestran como esferas rojas, con las eliminaciones indicadas en un contorno discontinuo, y están etiquetadas en el monómero con un RBD erecto. b – g, Los títulos de neutralización sérica del 50% de la primera dosis de la vacuna (b, c, n = 37), la segunda dosis de la vacuna (d, e, n = 21) y los sueros de convalecientes (f, g, n = 27) contra la proteína de pico de tipo salvaje (WT) y la proteína de pico de la variante B.1.1.7 (que contiene las mutaciones N501Y, A570D, ΔH69/ΔV70, ΔY144, P681H, T716I, S982A y D1118H). HS, control de suero humano. b, d, f, los cambios medios en ID50 se indican encima de los gráficos. Los puntos de datos del mismo individuo están conectados por líneas. Los datos son GMT ± sd y valores individuales de dos experimentos independientes, cada uno con dos repeticiones técnicas. Prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon de dos colas sin ajuste para comparaciones múltiples; **P < 0,01, ****P < 0,0001. El límite para una neutralización del 50% se fijó en 4.

Luego generamos pseudovirus mutados que portaban la proteína de pico con las sustituciones N501Y y A570D y la eliminación H69/V70 (ΔH69/ΔV70). Observamos un pequeño aumento en la capacidad de los sueros de personas vacunadas o que se habían recuperado de COVID-19 para inhibir este virus triple mutante (Datos ampliados, figuras 2a a c). A continuación, incluimos el conjunto completo de ocho mutaciones en la proteína de pico que está presente en la variante B.1.1.7 (Fig. 1a). De los 29 sueros con actividad de neutralización después de la primera dosis, 20 mostraron evidencia de una reducción en los títulos de neutralización contra la variante B.1.1.7 (Fig. 1b, cy Datos ampliados Fig. 3), con un cambio de 3,2 ± 5,7 (media ± DE). Después de la segunda dosis, el GMT aumentó notablemente en comparación con los títulos de la primera dosis, con un cambio de 1,9 ± 0,9 (media ± sd) (Fig. 1d, e). Entre los sueros de 27 personas que se habían recuperado de COVID-19, el GMT con una neutralización del 50 % fue de 1334 para la proteína de pico de tipo salvaje, que es significativamente más alto que el GMT después de la segunda dosis de la vacuna (Fig. 1f, g). . El cambio en ID50 para la neutralización de B.1.1.7 en comparación con la proteína de pico de tipo salvaje (D614G) fue de 4,5 ± 8,7 (Fig. 1f, gy Datos ampliados Fig. 4).

La sustitución E484K (Fig. 2a) se ha informado como una mutación de escape para varios anticuerpos monoclonales5 y está presente en los linajes B.1.351 (501Y.V2) y P.1 (501Y.V3). Al 11 de febrero de 2021, 30 secuencias B.1.1.7 también tenían la sustitución E484K (Fig. 2c). El análisis filogenético sugiere que ha habido múltiples adquisiciones independientes, y un linaje parece expandirse con el tiempo, lo que indica una transmisión activa (Fig. 2b). Esto ha dado lugar a que Public Health England la denomine variante preocupante (VOC 202102/02)6. Por lo tanto, generamos pseudovirus que portaban las mutaciones de pico B.1.1.7 con o sin la sustitución adicional E484K y los probamos contra sueros obtenidos después de la primera y segunda dosis de la vacuna de ARNm BNT162b2, así como contra sueros de convalecientes. Después de la segunda dosis de vacuna, observamos una pérdida considerable de actividad neutralizante para el pseudovirus con las mutaciones de pico B.1.1.7 y E484K (Fig. 3d, e). El cambio medio para la variante de pico B.1.1.7 que contiene E484K fue 6,7 en comparación con 1,9 para la variante B.1.1.7, en relación con la proteína de pico de tipo salvaje (Fig. 3a-c y Datos ampliados, Fig. 5). ). De manera similar, cuando probamos un panel de sueros convalecientes con un rango de títulos de neutralización (Fig. 1f, gy Datos ampliados Fig. 5), observamos una pérdida adicional de actividad contra el pico mutante B.1.1.7 con E484K, con veces cambio de 11,4 en relación con la proteína de pico de tipo salvaje (Fig. 3f, gy Datos ampliados Fig. 5).

a, Representación de la interfaz de pico RBM:ACE2 (PDB: 6M0J) con los residuos E484, N501 y K417 resaltados como esferas coloreadas por elemento. b, Filogenia de máxima probabilidad de un subconjunto de secuencias del Reino Unido con la mutación E484K (azul) y el linaje B.1.1.7 (verde), con secuencias de fondo del Reino Unido sin mutaciones RBD mostradas en negro. Al 11 de febrero de 2021, 30 secuencias del linaje B.1.1.7 (un grupo de 25 en la parte superior del árbol filogenético) adquirieron la sustitución E484K (rojo). c, Acumulación de secuencia a lo largo del tiempo en GISAID para secuencias del Reino Unido de B.1.1.7 y otras variantes con o sin E484K.

Todas las variantes del virus estaban en un fondo de pico (D614G). a, Ejemplos de curvas de neutralización de individuos vacunados (ID 5, 7, 18, 28). La dilución inversa se muestra en una escala logarítmica. Los datos son media ± sem representativos de dos experimentos independientes, cada uno con dos réplicas técnicas. b – g, Los títulos de neutralización del 50% de cada virus contra los sueros obtenidos después de la primera dosis de vacuna (b, c, n = 37), la segunda dosis de vacuna (d, e, n = 21) y para los sueros de convalecientes (f, g, n = 20) expresado como cambio en veces en relación con el virus de tipo salvaje. b, d, f, los cambios medios en ID50 se indican encima de los gráficos. Los datos son media ± DE y valores individuales; Las barras de error para valores negativos no se muestran. c, e, g, Los datos son el cambio medio de dos réplicas técnicas y son representativos de dos experimentos independientes. Los puntos de datos del mismo individuo están conectados por líneas. b, d, f, prueba t de Student pareada de dos colas; *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001; NS, no significativo. El límite para una neutralización del 50% se fijó en 4.

Probamos 60 anticuerpos monoclonales aislados de 15 personas que se habían recuperado de la infección por SARS-CoV-2 a principios de 2020 con un ensayo de neutralización pseudotipado in vitro contra la proteína de pico B.1.1.7 (Tabla complementaria 1). De 60 anticuerpos monoclonales, 20 (33,3%) mostraron una pérdida de actividad neutralizante superior al doble contra la variante B.1.1.7 en comparación con el SARS-CoV-2 de tipo salvaje (Fig. 4a, by Datos ampliados, Fig. 6). ). El virus mutante B.1.1.7 escapó completamente a la neutralización por 8 de cada 10 anticuerpos monoclonales (80%) que se dirigen al dominio N-terminal (NTD) (Fig. 4c). De los 31 anticuerpos monoclonales que se dirigen al motivo de unión al receptor (RBM), 5 (16,1%) mostraron una disminución de más de 100 veces en la neutralización de B.1.1.7, y 6 anticuerpos monoclonales adicionales (19,4%) tuvieron una disminución parcial de 2- Reducción de 10 veces (Fig. 4d). Finalmente, todos los anticuerpos monoclonales no dirigidos a RBM específicos de RBD que se probaron conservaron completamente la actividad neutralizante contra B.1.1.7 (Fig. 4e).

a, Neutralización del virus de la leucemia murina (MLV) pseudotipado del SARS-CoV-2 que porta un pico de tipo salvaje (pico (D614G)) (gris), un pico de B.1.1.7 (azul) o una proteína de pico triple mutante ( TM, que porta las mutaciones de RBD K417N, E484K y N501Y) (rojo) por tres anticuerpos monoclonales seleccionados (S2E12, S2X333 y S2H14) de un experimento representativo. Los datos son media ± DE de dos réplicas técnicas. b, Neutralización de SARS-CoV-2: MLV que portan un pico de tipo salvaje (pico (D614G)), un pico de B.1.1.7 o una proteína de pico triple mutante (pico (N501Y, E484K, K417N)) por 60 virus monoclonales. anticuerpos dirigidos a NTD (n = 10), RBM (n = 31) o sitios que no son RBM en el RBD (n = 19). Los datos son los valores medios de concentración inhibidora del 50% (CI50) (ng ml-1) de n = 2 experimentos independientes. c – e, La neutralización por anticuerpos monoclonales específicos de NTD (c), específicos de RBM (d) y no específicos de RBM (e) se muestra como los valores medios de CI50 (arriba) y el cambio medio en B.1.1.7 (azul) o el triple mutante (spike(N501Y, E484K, K417N)) (rojo) en relación con el virus de tipo salvaje (abajo). La línea naranja muestra el umbral de títulos no neutralizantes. Arriba, los datos son valores medios ± SD de IC50 de dos experimentos independientes. Abajo, los datos son la media ± desviación estándar del cambio de dos experimentos independientes. f – h, La cinética de unión de anticuerpos monoclonales a RBD de tipo salvaje (negro), N501Y (azul) y E484K (rojo), medida mediante interferometría de biocapa. f, Se muestran los cuatro anticuerpos monoclonales dirigidos a RBM sin unión reducida al RBD con N501Y o E484K. g, h, Área bajo la curva (AUC) (g) y el cambio en veces en el área bajo la curva (h) de 50 anticuerpos monoclonales probados contra el RBD de tipo salvaje, N501Y y E484K. Los anticuerpos monoclonales con un cambio de más de 1,3 veces (corte indicado por la línea naranja) en el área bajo la curva se muestran en azul y rojo; Los puntos naranjas muestran anticuerpos monoclonales no específicos de RBM.

Para abordar el papel de la sustitución de N501Y en B.1.1.7 en el escape de neutralización de los anticuerpos específicos de RBM, probamos la unión de 50 anticuerpos monoclonales específicos de RBD al RBD de tipo salvaje y mutante N501Y mediante interferometría de biocapa (Fig. .4f y Datos ampliados Fig. 7). Los 5 anticuerpos monoclonales específicos de RBM que no neutralizaron la variante B.1.1.7 (Fig. 4d) mostraron una pérdida completa de unión al RBD mutante N501Y (Fig. 4g, h), lo que demuestra un papel para esta mutación como un mecanismo de escape para ciertos anticuerpos monoclonales dirigidos a RBM.

Para evaluar el efecto de E484K en este panel de anticuerpos monoclonales, generamos un virus pseudotipo SARS-CoV-2 triple mutante que porta las mutaciones K417N, E484K y N501Y (pico (N501Y, E484K, K417N)). La inclusión de la sustitución K417N fue motivada por la observación de que se han encontrado sustituciones en esta posición en cinco secuencias de aislados virales recientes dentro del linaje B.1.1.7 (K417 a Asn, Glu o Arg). Esto está en consonancia con la evolución convergente del virus a un RBD que contiene N501Y, E484K y K417N o K417T, como lo demuestran los linajes B.1.351 y P.1. En particular, se informa que las mutaciones en K417 escapan a la neutralización por anticuerpos monoclonales, incluido el anticuerpo monoclonal recientemente aprobado LY-CoV0165,7. De los 60 anticuerpos monoclonales analizados, 20 (33,3%) mostraron una pérdida de actividad neutralizante contra el mutante de pico (N501Y, E484K, K417N) de más de 10 veces en comparación con el SARS-CoV-2 de tipo salvaje (Fig. 4a). , by Datos ampliados Fig. 6), y de estos 19 son anticuerpos monoclonales específicos de RBM. Como se indicó anteriormente, abordamos el papel de la sustitución de E484K en el escape de los anticuerpos específicos de RBM probando la unión de 50 anticuerpos monoclonales específicos de RBD al RBD de la proteína de pico de tipo salvaje y mutante E484K mediante interferometría de biocapa (Fig. 4f y datos ampliados Fig. 8). De los 19 anticuerpos monoclonales específicos de RBM que mostraron una reducción o pérdida de la neutralización del mutante de pico (N501Y, E484K, K417N) (Fig. 4d), 16 mostraron una pérdida total o parcial de la unión al RBD del mutante E484K ( Fig. 4g, h), lo que concuerda con los hallazgos de que E484K es una mutación importante para el escape viral8,9,10. Además, 3 de estos 16 anticuerpos monoclonales también perdieron la capacidad de unirse a un RBD que contenía la sustitución N501Y, lo que indica que una fracción de los anticuerpos específicos de RBM son sensibles a las sustituciones tanto N501Y como E484K. De manera similar, se demostró previamente que 3 de los 19 anticuerpos monoclonales que perdieron la neutralización contra el mutante Spike (N501Y, E484K, K417N) (S2D8, S2H7 y S2X128) perdieron la unión y la neutralización con el mutante K417V, y aquí se muestra que son sensibles a ya sea la sustitución N501Y o E484K.

Utilizando interferometría de biocapa, encontramos que la ACE2 humana se unía al RBD de la variante B.1.1.7 con una afinidad de 22 nM en comparación con una afinidad de 133 nM para el RBD de tipo salvaje (Datos ampliados, figura 9), de acuerdo con nuestras mediciones anteriores de escaneo de mutaciones profundas utilizando el dimérico ACE211. Aunque ACE2 se unió con tasas comparables a ambos RBD, la constante de tasa de disociación observada fue más lenta para B.1.1.7 que para el RBD de tipo salvaje (Tabla de datos ampliados 1). Estos hallazgos podrían explicar la transmisión eficiente y en curso de este linaje de SARS-CoV-2 recientemente emergente y la posible reducción de la oportunidad de unión de anticuerpos. Para comprender el efecto de las mutaciones en el triple mutante (K417N, E484K y N501Y), evaluamos la unión de ACE2 al RBD inmovilizado de la espiga (N501Y, E484K, K417N). Determinamos una afinidad de unión a ACE2 de 64 nM para el RBD de pico (N501Y, E484K, K417N), impulsada por una tasa de desactivación más rápida que la observada para el RBD de la variante B.1.1.7 pero más lenta que para el tipo salvaje. RBD. Proponemos que la mutación K417N es ligeramente perjudicial para la unión de ACE2, lo que explica la afinidad intermedia determinada por el RBD de Spike (N501Y, E484K, K417N) en comparación con B.1.1.7 y los RBD de tipo salvaje, probablemente como resultado de rompiendo el puente salino formado con el residuo D30 de ACE2.

La actividad neutralizante del suero es un correlato de la protección contra otros virus respiratorios, incluidos la influenza12 y el virus respiratorio sincitial, para los cuales se ha utilizado profilaxis con anticuerpos monoclonales en grupos de riesgo13,14. Los títulos de anticuerpos neutralizantes parecían estar altamente correlacionados con la protección de la vacuna contra la nueva exposición al SARS-CoV-2 en primates no humanos15,16.

Este estudio informa sobre la neutralización mediante sueros recolectados después de la primera y segunda dosis de la vacuna BNT162b2. Los participantes de este estudio eran adultos mayores, en línea con el objetivo de este grupo de edad en el lanzamiento inicial de la campaña de vacunación en el Reino Unido. Demostramos que la neutralización de un pseudovirus que contiene la proteína de pico con el conjunto completo de mutaciones que está presente en la variante B.1.1.7 mostró una pequeña reducción utilizando sueros de individuos que recibieron la vacuna BNT162b2 que fue más marcada después de la primera dosis que la segunda dosis. Esto podría estar relacionado con el aumento de la amplitud, potencia y/o concentración de anticuerpos después de la dosis de refuerzo. Otros estudios han informado de una pequeña reducción en la neutralización contra la variante B.1.1.7 en personas vacunadas con dos dosis de BNT162b217 y mRNA-127318. La actividad neutralizante reducida observada con los anticuerpos policlonales provocados por las vacunas de ARNm observadas en este estudio se ve respaldada aún más por la pérdida de actividad neutralizante observada con los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos tanto contra el RBD como, en mayor medida, contra el NTD.

Múltiples variantes, incluidos los linajes 501Y.V2 y B.1.1.7, tienen múltiples mutaciones y deleciones en el NTD, la mayoría de las cuales están ubicadas en un sitio de vulnerabilidad al que se dirigen todos los anticuerpos neutralizantes específicos de NTD conocidos19,20 . El papel de los anticuerpos neutralizantes específicos de las NTD podría subestimarse, en parte por el uso de ensayos de neutralización basados ​​en células diana que sobreexpresan los receptores ACE2. Se sugirió que los anticuerpos monoclonales específicos de NTD interfieren con la entrada viral basada en otros receptores accesorios, como DC-SIGN y L-SIGN21, y se encontró que su potencia de neutralización dependía de diferentes condiciones de cultivo in vitro19. La observación de que 9 de cada 10 anticuerpos neutralizantes específicos de NTD no mostraron una pérdida completa o casi completa de la actividad neutralizante contra B.1.1.7 indica que esta nueva variante también puede haber evolucionado para escapar de esta clase de anticuerpos, que pueden tienen un papel aún no reconocido en la inmunidad protectora. En conjunto, la presencia de múltiples mutaciones de escape en el NTD respalda la hipótesis de que esta región de la espiga, además de la RBM, también está bajo presión inmune.

Lo preocupante es que hemos demostrado que existen múltiples secuencias B.1.1.7 en el Reino Unido que contienen la sustitución E484K con evidencia temprana de transmisión, así como adquisiciones independientes. Medimos una reducción adicional en los títulos de neutralización mediante sueros de vacunas cuando E484K estaba presente junto con las mutaciones de pico B.1.1.7. Un estudio reciente18 también ha demostrado que las variantes que llevan la sustitución E484K dieron como resultado una reducción de 3 a 6 veces en la neutralización por sueros de individuos que recibieron la vacuna mRNA-1273. Consistentemente, en este estudio encontramos que aproximadamente el 50% de los anticuerpos monoclonales específicos de RBM probados perdieron actividad neutralizante contra el SARS-CoV-2 que portaba E484K. Se ha demostrado que E484K afecta la neutralización mediante anticuerpos monoclonales o sueros de convalecientes, especialmente en combinación con N501Y y K417N8,22,23,24.

Las vacunas son una parte clave de una estrategia a largo plazo para controlar la transmisión del SARS-CoV-2. Nuestros datos sugieren que el escape de la vacuna por parte del virus de las actuales vacunas dirigidas contra la cepa Wuhan-1 será inevitable, particularmente dado que E484K está surgiendo de forma independiente y recurrente sobre un fondo B.1.1.7 (501Y.V1), y dada la rápida propagación global de B.1.1.7. Otras variantes importantes con E484K, como 501Y.V2 y V3, también se están extendiendo a nivel regional. Esto debería mitigarse mediante el diseño de vacunas de próxima generación con secuencias de picos mutadas y el uso de antígenos virales alternativos.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos ni a la evaluación de resultados.

Los participantes que habían recibido la primera dosis de la vacuna BNT162b2 y las personas con COVID-19 recibieron su consentimiento para participar en la cohorte de COVID-19 del NIHR Bioresource. El estudio fue aprobado por el Comité Central de Ética en Investigación del Este de Inglaterra-Cambridge (17/EE/0025).

Las proteínas recombinantes de nucleocápside, pico y RBD del SARS-CoV-2 se acoplaron covalentemente a distintos conjuntos de cuentas carboxiladas (Luminex) para formar un triplex y se analizaron como se describió anteriormente25. La unión específica se informó como la intensidad media de fluorescencia.

Las sustituciones de aminoácidos se introdujeron en el plásmido D614G pCDNA_SARS-CoV-2_S como se describió anteriormente usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightening, siguiendo las instrucciones del fabricante (Agilent Technologies). Las secuencias se comprobaron mediante secuenciación de Sanger.

El plásmido que codifica la glicoproteína de pico del SARS-CoV-2 B.1.1.7 o triple mutante (pico (N501Y, E484K, K417N)) se utilizó para producir SARS-CoV-2-MLV según la PCR de extensión superpuesta de la siguiente manera. En resumen, se utilizó una modificación del protocolo de PCR de extensión de superposición27 para introducir las ocho mutaciones del linaje B.1.1.7 o las tres mutaciones del triple mutante (spike(N501Y, E484K, K417N)) en el SARS-CoV- 2 genes de pico. En un primer paso, se amplificaron mediante PCR nueve fragmentos de ADN con secuencias superpuestas a partir de un plásmido (phCMV1, Genlantis) que codifica el gen de pico de longitud completa del SARS-CoV-2 (BetaCoV/Wuhan-Hu-1/2019; número de acceso, mn908947). ). Las mutaciones (ΔH69/ΔV70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, S982A, T716I y D1118H o K417N, E484K y N501Y) se introdujeron mediante amplificación con cebadores con una temperatura de fusión similar. Se introdujo la eliminación de los 21 aminoácidos C-terminales para aumentar la expresión superficial de la proteína de pico recombinante28. A continuación, se fusionaron tres fragmentos superpuestos contiguos mediante una primera PCR superpuesta utilizando los cebadores más externos de cada conjunto, lo que dio como resultado tres fragmentos más grandes con secuencias superpuestas. Se realizó una PCR de superposición final en los tres fragmentos grandes utilizando los cebadores más externos para amplificar el gen de pico de longitud completa y las secuencias flanqueantes, incluidos los sitios de restricción KpnI y NotI. Este fragmento fue digerido y clonado en el plásmido de expresión phCMV1. Para todas las reacciones de PCR se utilizó la ADN polimerasa Q5 Hot Start High Fidelity (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante y adaptando el tiempo de elongación al tamaño del amplicón. Después de cada paso de PCR, las regiones amplificadas se separaron en un gel de agarosa y se purificaron utilizando un kit de purificación de banda de gel y ADN de PCR Illustra GFX (Merck).

Los vectores virales se prepararon mediante transfección de células HEK293T utilizando el reactivo de transfección Fugene HD (Promega). Las células HEK293T se transfectaron con una mezcla de 11 µl de Fugene HD, 1 µg de pCDNAD19spike-HA, 1 µg de vector de expresión p8.91 VIH-1 Gag-Pol29,30 y 1,5 µg de pCSFLW (que expresa el gen indicador de luciferasa de luciérnaga con la señal de empaquetado del VIH-1)31. Los sobrenadantes virales se recogieron a las 48 h y 72 h después de la transfección, se filtraron a través de un filtro de 0,45 μm y se almacenaron a -80 °C. La dosis infecciosa del 50 % en cultivo de tejidos del pseudovirus SARS-CoV-2 se determinó utilizando el sistema de ensayo Steady-Glo Luciferase (Promega).

Se ha demostrado que los ensayos de pseudotipo de pico tienen características similares a las pruebas de neutralización que utilizan SARS-CoV-232 de tipo salvaje totalmente infeccioso. Se realizaron ensayos de neutralización de virus en células HEK293T que se transfectaron transitoriamente con ACE2 y TMPRSS2 utilizando un virus pseudotipado de pico de SARS-CoV-2 que expresaba luciferasa33. El virus pseudotipado se incubó con una dilución en serie de muestras de suero humano inactivadas por calor o sueros de individuos que fueron vacunados por duplicado durante 1 h a 37 °C. También se incluyeron controles de sólo virus y sólo de células. Luego, se agregaron a cada pocillo células HEK293T que expresan ACE2 y TMPRSS2 recién tripsinizadas. Después de la incubación durante 48 h en un ambiente con 5% de CO2 a 37 °C, se midió la luminiscencia utilizando el sistema de ensayo Steady-Glo o Bright-Glo Luciferase (Promega). La neutralización se calculó en relación con los controles de solo virus. Las curvas de dilución se muestran como la media ± neutralización sem. Los valores de ID50 se calcularon en GraphPad Prism. Los valores de ID50 dentro de los grupos se resumieron como GMT y las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron con pruebas de signos clasificados de Wilxocon. Además, los efectos de las mutaciones sobre el efecto neutralizante de los sueros se expresaron como un cambio en ID50 del virus de tipo salvaje en comparación con el virus pseudotipado mutante. La diferencia estadística en el cambio medio entre grupos se determinó mediante una prueba t de Student de dos colas.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) congeladas se descongelaron rápidamente y el medio de congelación se diluyó en 10 ml de medio TexMACS (Miltenyi Biotech), se centrifugó y se resuspendió en 10 ml de medio fresco con 10 U ml-1 de ADNasa (Benzonase, Merck- Millipore vía Sigma-Aldrich), las PBMC se incubaron a 37 °C durante 1 h, seguido de centrifugación y resuspensión en medio fresco suplementado con suero humano al 5% (Sigma-Aldrich) antes de contarse. Las PBMC se tiñeron con 2 µl de cada anticuerpo: isotiocianato de fluoresceína anti-CD3 (FITC), clon UCHT1; anti-CD4-ficoeritrina (PE), clon RPA-T4; anti-CD8a–peridinina-clorofila proteína-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), clon RPA-8a (todo BioLegend, Londres, Reino Unido), kit de tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Far Red (Thermo Fisher Scientific). El fenotipado de PBMC se realizó en el citómetro de flujo BD Accuri C6. Los datos se analizaron con FlowJo v.10 (Becton Dickinson). En resumen, se incubaron 1,5–2,5 × 105 PBMC en placas Fluorospot prerevestidas (IFNγ FLUOROSPOT humano (Mabtech)) por triplicado con mezclas de péptidos específicas de proteínas de pico, nucleocápside y membrana del SARS-CoV-2 (concentración final de péptido 1 μg ml- 1 por péptido, Miltenyi Biotech) y una mezcla de control positivo y no estimulada (que contiene anti-CD3 (Mabtech), enterotoxina B de Staphylococcus, fitohemaglutinina (todas Sigma-Aldrich)) a 37 °C en una atmósfera de CO2 humidificada durante 48 h. Se decantaron las células y el medio de la placa y se desarrolló el ensayo siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas reveladas se leyeron utilizando un lector AID iSpot (Oxford Biosystems) y se contaron utilizando el software AID EliSpot v.7 (Autoimmun Diagnostika). Luego, todos los datos se corrigieron para determinar la producción de citoquinas de fondo y se expresaron como unidades formadoras de manchas por millón de PBMC o células T CD3+.

Los anticuerpos monoclonales humanos se aislaron de células plasmáticas o células B de memoria de donantes que son inmunes al SARS-CoV o al SARS-CoV-2 como se describió anteriormente34,35,36,37. Los anticuerpos recombinantes se expresaron en células ExpiCHO a 37 °C y 8% de CO2. Las células se transfectaron usando ExpiFectamine. Las células transfectadas se complementaron 1 día después de la transfección con ExpiCHO Feed y ExpiFectamine CHO Enhancer. El sobrenadante del cultivo celular se recogió 8 días después de la transfección y se filtró a través de un filtro de 0,2 µm. Los anticuerpos recombinantes se purificaron por afinidad en un dispositivo FPLC ÄKTA xpress utilizando columnas HiTrap MabSelect PrismA de 5 ml, seguido de un intercambio de tampón por tampón de histidina (histidina 20 mM, sacarosa al 8 %, pH 6) utilizando columnas de desalinización HiPrep 26/10.

Los virus pseudotipados con glicoproteína S del SARS-CoV-2 basados ​​en MLV se prepararon como se describió anteriormente35. Las células HEK293T/17 se cotransfectaron con un plásmido que codifica la glicoproteína de pico del SARS-CoV-2 de tipo salvaje, B.1.1.7 o triple mutante (spike(N501Y, E484K, K417N)), una construcción de empaquetamiento MLV Gag-Pol y el vector de transferencia MLV que codifica un indicador de luciferasa usando el reactivo de transfección X-tremeGENE HP (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se cultivaron durante 72 h a 37 °C con 5% de CO2 antes de recoger el sobrenadante. Se cultivaron células VeroE6 que expresaban establemente TMPRSS2 humano en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% (100 UI ml-1 de penicilina, 100 μg ml-1), 8 μg ml-1 de puromicina y se sembraron en placas de 96 pocillos durante 16 a 24 h. Se incubó pseudovirus con una dilución en serie de anticuerpos monoclonales durante 1 hora a 37 °C y luego se añadió a los pocillos después de lavar dos veces con DMEM. Después de 2 a 3 h, se añadió a las células DMEM que contenía un 20% de suero bovino fetal y un 2% de penicilina-estreptomicina. Después de 48 a 72 h de infección, se añadió Bio-Glo (Promega) a las células y se incubó en la oscuridad durante 15 minutos antes de leer la luminiscencia utilizando un lector de microplacas Synergy H1 (BioTek). Las mediciones se realizaron por duplicado y las unidades relativas de luciferasa se convirtieron al porcentaje de neutralización y se representaron gráficamente con un modelo de regresión no lineal para determinar los valores de CI50 utilizando el software GraphPad Prism (v.9.0.0).

Los anticuerpos monoclonales (Tabla complementaria 1) se diluyeron a 3 μg ml-1 en tampón cinético (PBS suplementado con BSA al 0,01%) y se inmovilizaron en biosensores de proteína A (FortéBio). Los biosensores recubiertos con anticuerpos se incubaron durante 3 minutos con una solución que contenía 5 μg ml-1 de RBD SARS-CoV-2 de tipo salvaje, N501Y o E484K en tampón cinético, seguido de un paso de disociación de 3 minutos. Los cambios en las moléculas unidas a los biosensores provocaron un cambio en el patrón de interferencia que se registró en tiempo real utilizando un sistema Octet RED96 (FortéBio). La respuesta de unión a lo largo del tiempo se utilizó para calcular el área bajo la curva utilizando el software GraphPad Prism (v.9.0.0).

GenScript sintetizó la construcción SARS-CoV-2 RBD (BEI NR-52422) en CMVR con un péptido señal de mu-fosfatasa N-terminal, una etiqueta de octa-histidina C-terminal (GHHHHHHHHH) y una etiqueta avi. Los límites de la construcción son 328RFPN331 (terminal N) y 528KKST531 (terminal C)38. GenScript sintetizó el gen B.1.1.7 RBD en pCMVR con los mismos límites y detalles de construcción con una mutación en N501Y. Estos plásmidos se transfectaron transitoriamente en células Expi293F usando medio de expresión Expi293F (Life Technologies) a 37 °C y 8% de CO2 mientras se rotaba a 150 rpm. Los cultivos se transfectaron utilizando PEI cultivada durante 5 días. Los sobrenadantes se clarificaron mediante centrifugación (10 min a 4000 g) antes de cargarlos en una columna de níquel-NTA (GE Healthcare). La proteína purificada se biotiniló durante la noche usando BirA (biotina ligasa) antes de la cromatografía de exclusión por tamaño en PBS. Twist sintetizó ACE2-Fc humano (residuos 1-615 con un sitio de escisión de trombina C-terminal y etiqueta Fc humana). Los sobrenadantes clarificados se purificaron por afinidad utilizando una columna de Proteína A (GE Life Sciences) que se neutralizó directamente y se intercambió tampón. La etiqueta Fc se eliminó mediante escisión de trombina en una mezcla de reacción que contenía 3 mg de ectodominio ACE2-Fc recombinante y 10 μg de trombina en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y CaCl2 2,5 mM. La mezcla de reacción se incubó a 25 °C durante la noche y se volvió a cargar en una columna de Proteína A para eliminar la proteína no escindida y la etiqueta Fc. La proteína escindida se purificó adicionalmente mediante filtración en gel usando una columna Superdex 200 10/300 GL (GE Life Sciences) equilibrada en PBS.

Los RBD biotinilados (de pico de tipo salvaje, pico (N501Y) o pico (N501Y, E484K, K417N)) se inmovilizaron a 5 ng μl en tampón cinético 10 × (Pall) sin diluir en sensores SA hasta un nivel de carga de 1,1 nm. Se utilizó una serie de diluciones de ACE2 monomérico o Fab en tampón cinético sin diluir a partir de 1000 a 50 nM durante 300 a 600 s para determinar la afinidad proteína-proteína. Se restaron los datos iniciales y se ajustaron las parcelas utilizando el software de análisis Pall FortéBio/Sartorius (v.12.0). Los datos se trazaron en Graphpad Prism (v.9.0.2).

Todas las secuencias completas y excluidas de baja cobertura del SARS-CoV-2 se descargaron de la base de datos GISAID (http://gisaid.org/)39 el 11 de febrero de 2021. Todas las secuencias se realinearon con la cepa de referencia del SARS-CoV-2 MN908947. .3, usando MAFFT v.7.475 con selección automática de sabor y las opciones --–keeplength --addfragments40. Luego se deduplicaron las secuencias. Se asignaron membresías del clado principal del SARS-CoV-2 a todas las secuencias utilizando el servidor Nextclade v.0.12 (https://clades.nextstrain.org/).

Se produjeron árboles filogenéticos de máxima probabilidad utilizando el conjunto de datos curado anteriormente usando IQ-TREE v.2.1.241. La selección del modelo evolutivo para árboles se infirió utilizando ModelFinder10 y los árboles se estimaron utilizando el modelo GTR + F + I con 1000 réplicas de arranque ultrarrápido42. Todos los árboles se visualizaron con Figtree v.1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) y se manipularon y colorearon con ggtree v.2.2.4. Las filogenias se basaron en la secuencia de referencia del SARS-CoV-2 (MN908947.3) y en los nodos dispuestos en orden descendente.

Se utilizó regresión lineal para explorar la asociación entre la respuesta de anticuerpos, la respuesta de células T y la neutralización del suero en Stata 13. Se informó el coeficiente de correlación de Pearson.

La neutralización se calculó en relación con los controles de solo virus. Las curvas de dilución se presentaron como media ± neutralización sem. Los valores de IC50 se calcularon en GraphPad Prism. Los valores de ID50 dentro de los grupos se resumieron como GMT y las comparaciones estadísticas entre grupos se realizaron mediante pruebas de signos clasificados de Wilxocon. Además, los efectos de las mutaciones sobre el efecto neutralizante de los sueros se expresaron como el cambio en ID50 del virus de tipo salvaje en comparación con el virus pseudotipado mutante. La diferencia estadística en el cambio medio entre grupos se determinó mediante una prueba t de Student de dos colas.

La asociación entre la respuesta de células T asociada a picos, la respuesta de anticuerpos específicos de picos y la neutralización sérica se determinó mediante regresión lineal. Los coeficientes de correlación de Pearson entre estas variables se determinaron utilizando Stata 13.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este documento.

Los datos de neutralización e interferometría de biocapa que se muestran en la Fig. 4 y los datos ampliados de las Figs. 6 a 8 se pueden encontrar en los datos de origen de la figura 4. Todas las secuencias están disponibles públicamente y se descargaron de http://gisaid.org. Los datos deduplicados y submuestreados están disponibles gratuitamente en https://github.com/StevenKemp/sequence_files/blob/main/vaccinepaper/with_background_subsampled_deduped_aligned_UKonly_484_vui.fasta.gz. Otros datos están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05103-3

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Agradecemos al Departamento de Salud Ocupacional del NHS Trust de los Hospitales Universitarios de Cambridge; el Centro de Investigación Clínica NIHR Cambridge y el personal de CUH; E. Lim y G. Okecha; J. Voss por el regalo de células HeLa que expresan de forma estable ACE2. RKG cuenta con el respaldo de una beca senior en ciencias clínicas de Wellcome Trust (WT108082AIA). LEM cuenta con el apoyo del Premio al Desarrollo Profesional del Consejo de Investigación Médica (MR/R008698/1). SAK cuenta con el apoyo de la Fundación Bill y Melinda Gates a través de la subvención PANGEA OPP1175094. DAC cuenta con el apoyo de una beca de investigación de doctorado clínico de Wellcome Trust. KGCS recibió el premio Wellcome Investigator Award (200871/Z/16/Z). Esta investigación fue apoyada por el Centro de Investigación Biomédica de Cambridge del Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR), la Unidad de Ensayos Clínicos de Cambridge (CCTU) y NIHR BioResource. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (R01GM120553 a DV), el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (DP1AI158186 y HHSN272201700059C a DV), un Premio Pew Biomedical Scholars (DV), Investigadores en Patogénesis de Enfermedades Infecciosas Premios de enfermedades del Burroughs Wellcome Fund (DV) y Fast Grants (DV). Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NIHR o el Departamento de Salud y Atención Social. IATMF está financiado por un premio SANTHE (DEL-15-006).

Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Dami A. Collier, Anna De Marco, Isabella ATM Ferreira, Bo Meng, Rawlings P. Datir

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Davide Corti, Ravindra K. Gupta

Instituto de Inmunología Terapéutica y Enfermedades Infecciosas de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Dami A. Collier, Isabella ATM Ferreira, Bo Meng, Rawlings P. Former, Steven A. Kemp, Kenneth GC Smith y Ravindra K. Gupta

Departamento de Medicina, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Dami A. Collier, Isabella ATM Ferreira, Bo Meng, Rawlings P. Datir, Steven A. Kemp, Stephen Baker, Gordon Dougan, Christoph Hess, Paul J. Lehner, Paul A. Lyons, Nicholas J. Matheson, James ED Thaventhiran, Michael P. Weekes, Ben Bullman, Kelvin Hunter, Federica Mescia, Nicole Pond, Laura Bergamaschi, Ariana Betancourt, Georgie Bower, Chiara Cossetti, Madeline Epping, Andrew Hinch, Veronika Romashova, Lori Turner, Kenneth GC Smith, John R. Bradley, Catherine Ludden, Ewan M. Harrison, Dinesh Aggarwal, Alessandro M. Carabelli, Michael H. Spencer Chapman, Chris Ruis, Sharon J. Peacock, Beth Blane, Sophia T. Girgis, Katherine L. Bellis, Nazreen F. Hadjirin, Leanne M Kermack, Michael R. Chapman, Sophie Palmer, Carol M. Churcher, Ellena Brooks, Kim S. Smith, Katerina Galai, Georgina M. McManus, Danielle Leek, Sushmita Sridhar, Sally Forrest, Claire Cormie, Harmeet K. Gill, Joana Dias, Ellen E. Higginson, Mailis Maes, Jamie Young, Elias Allara, Clare Pearson, Mark Wills y Ravindra K. Gupta

División de Infección e Inmunidad, University College London, Londres, Reino Unido

Dami A. Collier, Rawlings P. Datir, Steven A. Kemp, Stephen Baker, Gordon Dougan, Christoph Hess, Paul J. Lehner, Paul A. Lyons, Nicholas J. Matheson, Charlotte Summers, James ED Thaventhiran, Mark Toshner, Benjamin J. Dunmore, Stefan Gräf, Josh Hodgson, Christopher Huang, Kelvin Hunter, Ekaterina Legchenko, Cecilia Matara, Jennifer Martin, Federica Mescia, Ciara O'Donnell, Linda Pointon, Nicole Pond, Joy Shih, Rachel Sutcliffe, Tobias Tilly, Carmen Treacy , Zhen Tong, Jennifer Wood, Laura Bergamaschi, Ariana Betancourt, Georgie Bower, Chiara Cossetti, Aloka De Sa, Madeline Epping, Andrew Hinch, Sarah Jackson, Isobel Jarvis, Daniel Lewis, Joe Marsden, Georgina Okecha, Ommar Omarjee, Marianne Perera, Nathan Richoz, Veronika Romashova, Natalia Savinykh Yarkoni, Rahul Sharma, Lori Turner, Eckart MDD De Bie, Katherine Bunclark, Michael Mackay, Mayurun Selvan, Laura E. McCoy y M. Estee Torok

Humabs Biomed SA, una subsidiaria de Vir Biotechnology, Bellinzona, Suiza

Anna De Marco, Jessica Bassi, Dora Pinto, Chiara Silacci-Fregni, Siro Bianchi, Katja Culap, Stefano Jaconi, Elisabetta Cameroni, Matteo S. Pizzuto, Antonio Lanzavecchia, Luca Piccoli y Davide Corti

Departamento de Bioquímica, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Alexandra C. Walls, M. Alejandra Tortorici, John Bowen y David Veesler

Vir Biotechnology, San Francisco, CA, EE. UU.

György Snell y Herbert W. Virgin

Clínica de Medicina Interna y Enfermedades Infecciosas, Clínica Luganese Moncucco, Lugano, Suiza

Alessandra Franzetti Pellanda y Christian Garzoni

División de Enfermedades Infecciosas, Hospital Luigi Sacco, Universidad de Milán, Milán, Italia

Agostino Riva

Centro de investigación clínica NIHR Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Ana Elmer

NIHR Bioresource, Cambridge, Reino Unido

Nathalie Kingston, Barbara Graves y John R. Bradley

Universidad de Kent, Canturbury, Reino Unido

Nathalie Kingston, Stefan Gräf, John Allison, Helen Butcher, Daniela Caputo, Debbie Clapham-Riley, Eleanor Dewhurst, Anita Furlong, Barbara Graves, Jennifer Gray, Tasmin Ivers, Mary Kasanicki, Emma Le Gresley, Rachel Linger, Sarah Meloy, Francesca Muldoon , Nigel Ovington, Sofia Papadia, Isabel Phelan, Hannah Stark, Kathleen E. Stirrups, Paul Townsend, Neil Walker, Jennifer Webster y Nigel Temperton

Departamento de Bioquímica Clínica e Inmunología, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Lourdes Cerón-Gutiérrez, Gabriela Bárcenas-Morales y Rainer Doffinger

Laboratorio de Inmunologia, UNAM, Cuautitlán, Mexico

Gabriela Barcenas-Morales

Instituto de Biodiversidad, Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido

Guillermo Harvey

Departamento de Hematología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Nathalie Kingston, Willem H. Owehand, Stefan Gräf, Luca Stefanucci, Jonathan Stephens, John Allison, Nigel Ovington, Kathleen E. Stirrups, Paul Townsend, Neil Walker, Chris Jackson, Rainer Doffinger y Ravindra K. Gupta

Universidad de KwaZulu Natal, Durban, Sudáfrica

Ravindra K. Gupta

Instituto Africano de Investigaciones en Salud, Durban, Sudáfrica

Ravindra K. Gupta

Departamento de Enfermedades Infecciosas, NHS Trust de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Ravindra K. Gupta

Departamento de Biomedicina, Universidad de Basilea y Hospital Universitario de Basilea, Basilea, Suiza

Cristopher Hess

Centro de Investigación Botnar para la Salud Infantil (BRCCH), Universidad de Basilea y ETH Zurich, Basilea, Suiza

Cristopher Hess

Centro de Investigación Clínica de Cambridge, Centro de Investigación Clínica NIHR, Fundación NHS de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Caroline Saunders, Ashlea Bucke, Jo Calder, Laura Canna, Jason Domingo, Anne Elmer, Stewart Fuller, Sarah Hewitt, Jane Kennet, Sherly Jose, Jenny Kourampa, Anne Meadows, Jane Price, Cherry Publico, Rebecca Rastall, Carla Ribeiro, Jane Rowlands , Valentina Ruffolo y Hugo Tordesillas

Instituto de Investigación del Corazón y los Pulmones, Cambridge, Reino Unido

Charlotte veranos y marca toshner

Royal Papworth Hospital NHS Foundation Trust, Cambridge, Reino Unido

Charlotte Summers, Mark Toshner, Ali Ansaripour, Alice Michael, Lucy Mwaura, Caroline Patterson y Gary Polwarth

Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Charlotte Summers, Petra Polgarova, Giovanni di Stefano y Mary Kasanicki

Unidad de Toxicología del MRC, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

James ED Thaventhiran

Departamento de Medicina, Universidad de Cardiff, Cardiff, Reino Unido

Julie Harris, Criona O'Brien, Thomas R. Connor, Anna Price, Joel Southgate, Christine Kitchen, Huw Gulliver, Ian Merrick, Martyn Guest, Robert Munn, Angela Marchbank, Trudy Workman, William Fuller y Catherine Bresner

Instituto de Investigación Médica de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Stuart Fawke

Departamento de Medicina Veterinaria, Cambridge, Reino Unido

Emma Jones

Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Marta Wylot

Cancer Research UK, Instituto de Cambridge, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Richard Grenfell y Mateusz Strezlecki

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital de Maternidad Rosie, Cambridge, Reino Unido

pollo oisin

Centro de Innovación Enzimática, Universidad de Portsmouth (PORT), Portsmouth, Reino Unido

Francesca Nice, Samuel C. Robson y Angela H. Beckett

Instituto de Microbiología e Infecciones, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Masa Josipovic, Nicholas J. Loman, Sam Nicholls, Claire McMurray, Alan McNally, Joshua Quick, Radoslaw Poplawski, Joanne Stockton y Will Rowe

Departamento de Cirugía, Hospital Addenbrooke, Cambridge, Reino Unido

Sabrina Rossi y Cissy Yong

Bioquímica y Genética Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado, Aurora, CO, EE. UU.

sara spencer

Cambridge and Peterborough Foundation Trust, Fulbourn Hospital, Fulbourn, Reino Unido

Codie Fahey y Rachel Michel

Centro Nacional Australiano de Fenomas, Universidad de Murdoch, Murdoch, Australia Occidental, Australia

Se-How Bong

Centro de Medicina Molecular y Terapéutica Innovadora, Health Futures Institute, Universidad Murdoch, Perth, Australia Occidental, Australia

Jerome D. Coudert

Centro de Medicina Computacional y de Sistemas, Health Futures Institute, Universidad Murdoch, Perth, Australia Occidental, Australia

Elaine Holmes

Departamento de Salud Pública y Atención Primaria, Facultad de Medicina Clínica, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Helen Butcher, Daniela Caputo, Debbie Clapham-Riley, Eleanor Dewhurst, Anita Furlong, Barbara Graves, Jennifer Gray, Tasmin Ivers, Emma Le Gresley, Rachel Linger, Sarah Meloy, Francesca Muldoon, Sofia Papadia, Isabel Phelan, Hannah Stark y Jennifer Webster

Public Health Wales NHS Trust, Cardiff, Reino Unido

Thomas R. Connor, Sally Corden, Catherine Moore, Joanne Watkins, Matthew Bull, Nicole Pacchiarini, Simon Cottrell, Sara Rey, David Heyburn, Chris Williams, Malorie Perry, Noel Craine, Alec Birchley, Alexander Adams, Amy Plimmer, Bree Gatica- Wilcox, Caoimhe McKerr, Ember Hilvers, Hannah Jones, Hibo Asad, Jason Coombes, Johnathan M. Evans, Laia Fina, Lauren Gilbert, Lee Graham, Michelle Cronin, Sara Kumziene-Summerhayes, Sarah Taylor, Sophie Jones, Joel Southgate, Giri Shankar , Rachel Jones, Robin Howe, Alisha Davies, Elen De Lacy, Fatima Downing, Sue Edwards, Laura Gifford, Mari Morgan y Amy Gaskin

Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Tanya Golubchik, David Bonsall y Christophe Fraser

Departamento de Virología, King's College London, Londres, Reino Unido

Rocío T. Martínez Núñez & Themoula Charalampous

Departamento de Genómica de Patógenos, Wellcome Sanger Institute, Londres, Reino Unido

Ian Johnston, David K. Jackson, Ewan M. Harrison, Sonia Goncalves, Rich Livett, Roberto Amato, Jeff Barrett, Dinesh Aggarwal, Cordelia F. Langford, John Sillitoe, Dominic Kwiatkowski, Mara Lawniczak, Alex Alderton, Inigo Martincorena, Andrew R Bassett, Cristina V. Ariani, Michael H. Spencer Chapman, Laura Letchford, Steve Palmer, Danni Weldon, Naomi R. Park, Karen Oliver, Steven Leonard, Jillian Durham, Robert Davies, Mathew A. Beale, Katherine L. Bellis, Matthew J. Dorman, Eleanor Drury, Leanne Kane, Sally Kay, Samantha McGuigan, Rachel Nelson, Liam Prestwood, Shavanthi Rajatileka, Robin J. Moll, Marina Gourtovaia, Gerry Tonkin-Hill, Kevin Lewis, Jaime M. Tovar-Corona, Keith James, Jon-Paul Keatley, John Danesh, Michael R. Chapman, Charlotte Beaver, Luke Foulser, Sushmita Sridhar, Dorota Jamrozy, Stephanie Lo, Minal Patel, Emma Betteridge, Ben W. Farr, Scott Goodwin, Michael A. Quail, Carol Scott, Lesley Shirley, Scott AJ Thurston, Diana Rajan, Iraad F. Bronner, Louise Aigrain, Nicholas M. Redshaw, Stefanie V. Lensing, Shane McCarthy, Alex Makunin, James Bonfield, Christoph Puethe, Andrew Whitwham y Jennifier Liddle

Departamento de Medicina, Universidad de Brighton, Brighton, Reino Unido

Colin P. Smith, Giselda Bucca y Andrew R. Hesketh

Departamento de Innovación en Genómica, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Ali R. Awan y Chloe L. Fisher

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Fundación NHS de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

M. Estee Torok y William L. Hamilton

Departamento de Microbiología, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Reino Unido

M. Estee Torok y William L. Hamilton

Departamento de Medicina, Hospital Universitario de Southampton NHS Foundation Trust, Southampton, Reino Unido

Kordo Saeed, Jacqui A. Prieto, Siona Silveira, Emanuela Pelosi, Eleri Wilson-Davies, Adhyana IK Mahanama, Buddhini Samaraweera y Sarah Jeremiah

Facultad de Medicina, Departamento de Medicina, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

Kordo Saeed

Facultad de Ciencias de la Salud, Departamento de Medicina, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

Jacqui A. Prieto

Departamento de Investigación de Diagnóstico e Infecciones Clínicas, St Thomas' Hospital y Kings College London, Londres, Reino Unido

Luke B. Snell y Amita Patel

Belfast Health & Social Care Trust, Belfast, Reino Unido

Derek J. Fairley, James P. McKenna y Tanya Curran

Departamento de Medicina, Queen's University Belfast, Belfast, Reino Unido

Derek J. Fairley, David A. Simpson, Declan T. Bradley, Zoltan Molnar, Thomas Thompson y Erwan Acheson

Departamento de Secuencia Profunda, Facultad de Ciencias de la Vida, Centro Médico de Queens, Universidad de Nottingham, Nottingham, Reino Unido

Matthew W. Loose, Nadine Holmes, Christopher Moore, Matthew Carlile, Victoria Wright, Fei Sang y Johnny Debebe

Fundación NHS de la Universidad de East Kent Hospitals, Canterbury, Reino Unido

Samuel Moisés y Hannah Lowe

Departamento de Medicina, Universidad de Kent, Canterbury, Reino Unido

Samuel Moisés

Centro de biotecnología en el entorno construido, Universidad de Northumbria, Newcastle-Upon-Tyne, Reino Unido

Darren L. Smith, Matthew Bashton y Gregory R. Young

Departamento de Medicina, Universidad de Northumbria, Newcastle-Upon-Tyne, Reino Unido

Darren L. Smith, Matthew Bashton, Andrew Nelson, Gregory R. Young, Clare M. McCann y Wen C. Yew

NU-OMICS, Universidad de Northumbria, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido

Darren L. Smith, Andrew Nelson y Clare M. McCann

Centro de Vigilancia de Patógenos Genómicos, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

David M. Aanensen, Anthony P. Underwood, Corin A. Yeats, Khalil Abudahab, Ben EW Taylor y Mirko Menegazzo

Laboratorio de Microbiología Clínica y Salud Pública, Salud Pública de Inglaterra, Cambridge, Reino Unido

Martín D. Curran y Surendra Parmar

Salud Pública de Inglaterra, Londres, Reino Unido

Dinesh Aggarwal, Husam Osman, Meera Chand, Sharon J. Peacock, Esther Robinson, Peter Muir, Ian B. Vipond, Andrew Bosworth, Hannah M. Pymont, Stephanie Hutchings, Alicia Thornton, Richard Myers, Ian Harrison, Chloe Bishop, Vicki Chalker , Richard Hopes, Nicholas W. Machin, Shazaad SY Ahmad, Angie Lackenby, Tamyo Mbisa, Steven Platt, Shahjahan Miah, David Bibby, Carmen Manso, Jonathan Hubb, Gavin Dabrera, Mary Ramsay, Daniel Bradshaw, Ulf Schaefer, Natalie Groves, Eileen Gallagher, David Lee, David Williams, Nicholas Ellaby, Hassan Hartman, Nikos Manesis, Vineet Patel, Juan Ledesma, Katherine A. Twohig, Elias Allara y Clare Pearson

MRC–Centro de Investigación de Virus de la Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido

James G. Shepherd, Emma C. Thomson, David L. Robertson, Kathy K. Li, Rajiv N. Shah, Natasha G. Jesudason, Ana da Silva Filipe, Igor Starinskij, Richard J. Orton, Joseph Hughes, Sreenu Vattipally, Joshua B. Singer, Patawee Asamaphan, Marc O. Niebel, Lily Tong, Alice Broos, Daniel Mair, Jenna Nichols, Stephen N. Carmichael, Kyriaki Nomikou, Elihu Aranday-Cortes, Natasha Johnson y Seema Nickbakhsh

Universidad de Sheffield, Sheffield, Reino Unido

Matthew D. Parker, Untilhan I. de Silva, Dennis Wang, Matthew Wyles, Danielle C. Groves, Peijun Zhang, Marta Gallis, Stavroula F. Louka, Benjamin B. Lindsey, Timothy M. Freeman, Nikki Smith, Alexander J. Keeley , David G. Partridge, Mohammad Raza, Cariad Evans, Kate Johnson, Adrienn Angyal, Luke R. Green, Paul J. Parsons, Rachel M. Tucker, Rebecca Brown y Max Whiteley

Portsmouth Hospitals University NHS Trust, Portsmouth, Reino Unido

Sharon Glaysher, Anoop J. Chauhan, Scott Elliott, Kelly Bicknell, Sarah Wyllie, Allyson Lloyd y Robert Impey

Facultad de Farmacia y Ciencias Biomédicas, Universidad de Portsmouth (PORT), Portsmouth, Reino Unido

Katie F. Loveson, Salman Goudarzi, Christopher Fearn, Kate Cook, Hannah Dent y Hannah Paul

NHS Lothian, Edimburgo, Reino Unido

Kate E. Templeton, Martin P. McHugh, Rebecca Dewar y Elizabeth Wastenge

Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido

Kate E. Templeton, Andrew Rambaut, Stefan Rooke, Áine O'Toole, Thomas Williams, Verity Hill, Carlos E. Balcazar, Michael D. Gallagher, Kathleen A. Williamson y Thomas D. Stanton

Departamento de Medicina, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Dominic Kwiatkowski

Instituto Quadram de Biociencias, Norwich, Reino Unido

Justin O'Grady, Andrew J. Page, Gemma L. Kay, Nabil-Fareed Alikhan, Alexander J. Trotter, Leonardo de Oliveira Martins, Alison E. Mather, Lizzie Meadows, David J. Baker, Steven Rudder, Alp Aydin y Thanh Le-Viet

Departamento de Medicina, Universidad de East Anglia, Norwich, Reino Unido

Justin O'Grady y Rose K. Davidson

Salud Pública de Escocia, Glasgow, Reino Unido

Matthew TG Holden, Sharif Shaaban y Seema Nickbakhsh

Hospital Heartlands, Birmingham, Reino Unido

Husam Osman, Esther Robinson, Andrew Bosworth y Li Xu-McCrae

Departamento de Medicina, Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford, Reino Unido

Monique Andersson, Anita Justice, Timothy Peto, David Eyre y Derrick Crook

Departamento de Medicina, Hospitales Universitarios de Brighton y Sussex NHS Trust, Brighton, Reino Unido

Mohammed O. Hassan-Ibrahim, Cassandra S. Malone y Benjamin J. Cogger

Departamento de Medicina, Universidad de Warwick, Warwick, Reino Unido

Chrystala Constantinidou, Meera Unnikrishnan, Richard Stark, Sascha Ott, Laura Baxter, Mohammad T. Alam, Jeffrey KJ Cheng, Hannah E. Bridgewater, Lucy R. Frost, Grace Taylor-Joyce y Paul E. Brown

Departamento de Medicina, Universidad de Liverpool, Liverpool, Reino Unido

Alistair C. Darby, Julian A. Hiscox, Steve Paterson, Miren Iturriza-Gomara, Anita O. Lucaci, Sam T. Haldenby, Kathryn A. Jackson, Lance Turtle, Edith E. Vamos, Margaret Hughes, Lucille Rainbow, Richard Eccles, Charlotte Nelson, Mark Whitehead, Richard Gregory, Matthew Gemmell, Claudia Wierzbicki y Hermione J. Webster

Departamento de Medicina, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Erik M. Volz, Manon Ragonnet-Cronin, Fabricia F. Nascimento, David Jorgensen, Olivia Boyd, Lily Geidelberg, Aileen Rowan, Graham P. Taylor, Igor Siveroni y Rob Johnson

Departamento de Zoología, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Oliver G. Pybus, Louis du Plessis, Alex E. Zarebski, Jayna Raghwani, Moritz UG Kraemer, Stephen W. Attwood, Sarah Francois, Tetyana I. Vasylyeva, Navy Staircase Zamudio y Bernardo Gutiérrez

Fideicomiso de la Fundación NHS de los Hospitales de Newcastle, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido

Yusri Taha, Jennifer Collins, Gary Eltringham, Brendan AI Payne, Shirelle Burton-Fanning y Sheila Waugh

División de Virología, Departamento de Patología, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Aminu S. Jahun, Myra Hosmillo, Grant Hall, Yasmin Chaudhry, Malte L. Pinckert e Iliana Georgana

Hospitales Universitarios de Coventry y Warwickshire, Coventry, Reino Unido

Sarojini Pandey, Dimitris Grammatopoulos, Lisa Berry y Katie Jones

Universidad de Exeter, Exeter, Reino Unido

Ben Temperton, Stephen L. Michell, Aaron R. Jeffries, Jane AH Masoli, Bridget A. Knight, Christopher R. Jones, Claire M. Bewshea, Sian Ellard, Michelle L. Michelsen, Joanna Warwick-Dugdale, Robin Manley, Audrey Farbos , James W. Harrison, Christine M. Sambles y David J. Studholme

University College de Londres, Londres, Reino Unido

Sunando Roy, Judith Breuer, Rachel J. Williams, Mark Christiansen, Charlotte A. Williams, John A. Hartley, Adam P. Westhorpe, Riaz Janno, Helen L. Lowe, Angeliki Karamani, Leah Ensell, Marius Cotic y Nadua Bayzid

Wellcome Center for Human Genetics, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Mariateresa de Cesare, John A. Todd, David Buck, Angie Green, Amy Trebes y George MacIntyre-Cockett

Junta de Salud de la Universidad Betsi Cadwaladr, Betsi Cadwaladr, Reino Unido

Helena Adams

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Portsmouth (PORT), Portsmouth, Reino Unido

Yann Bourgeois y Garry P. Scarlett

Facultad de Medicina de Warwick e Instituto de Diagnóstico de Precisión y Patología, UHCW NHS Trust, Warwick, Reino Unido

Dimitris Grammatopoulos

Centro de Investigación de Diagnóstico e Infecciones Clínicas, Departamento de Enfermedades Infecciosas, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Jonathan Edgeworth, Rahul Batra, Themoula Charalampous y Gaia Nebbia

Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Judith Breuer, Kathryn Ann Harris, Julianne Rose Brown, Nathaniel Storey, Divya Shah, Laura Atkinson y Jack CD Lee

Junta de Salud de la Universidad de Cardiff y Vale, Cardiff, Reino Unido

Michaela John, Sian Morgan, Joshua Maksimovic, Karla Spellman, Kathryn McCluggage, Robert Beer y Safiah Afifi

Laboratorio llave en mano, Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Alan McNally, Angus Best, Benita Percival, Jeremy Mirza, Oliver Megram, Megan Mayhew, Liam Crawford, Fiona Ashcroft, Emma Moles-García y Nicola Cumley

Gloucestershire Hospitals NHS Foundation Trust, Gloucester, Reino Unido

Juan Boyes

Departamento de Microbiología, Wye Valley NHS Trust, Hereford, Reino Unido

Venkat Sivaprakasam, Fenella Halstead y Wendy Hogsden

Sandwell and West Birmingham NHS Trust, Birmingham, Reino Unido

Tranprit Salluja, Melisa Louise Fenton, Ashok Dadrah y Amanda Symmonds

Hospital Universitario de Norfolk y Norwich, Norwich, Reino Unido

Samir Dervisevic, Emma J. Meader, Rachael Stanley y Lindsay Coupland

Royal Devon and Exeter NHS Foundation Trust, Exeter, Reino Unido

Jane AH Masoli, Bridget A. Knight, Christopher R. Jones, Sian Ellard y Cressida Auckland

Barking, Havering y Redbridge University Hospitals NHS Trust, Barking, Reino Unido

Cherian Koshy y Amy Ash

Hospital Reina Isabel, Birmingham, Reino Unido

Anna Casey y Liz Ratcliffe

Departamento de Microbiología, Hospital General de Kettering, Kettering, Reino Unido

Thomas Davis, Sahar Eldirdiri y Anita Kenyon

Microbiología clínica, Hospitales Universitarios de Leicester NHS Trust, Leicester, Reino Unido

Christopher Holmes, Paul Bird, Thomas Helmer, Karlie Fallon y Julian Tang

Imperial College Hospitals NHS Trust, Londres, Reino Unido

Paul Anthony Randell, Alison Cox, Pinglawathee Madona, Alison Holmes, James Price, Siddharth Mookerjee y Frances Bolt

Patología del Noroeste de Londres, Londres, Reino Unido

Paul Anthony Randell, Alison Cox y Pinglawathee Madonna

Royal Free NHS Trust, Londres, Reino Unido

Tabitha W. Mahungu, Dianne Irish-Tavares, Tanzina Haque, Jennifer Hart y Eric Witele

South Tees Hospitals NHS Foundation Trust, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido

Steven Liggett, Paul Baker, Stephen Bonner y Sarah Essex

North Cumbria Integrated Care NHS Foundation Trust, Carlisle, Reino Unido

Clive Graham, Edward Barton, Debra Padgett y Garren Scott

North Tees y Hartlepool NHS Foundation Trust, Stockton-on-Tees, Reino Unido

Emma Swindells y Jane Greenaway

Fideicomiso de la Fundación NHS del Condado de Durham y Darlington, Durham, Reino Unido

Sharon Campbell, Veena Raviprakash, Nicola Sheriff, Victoria Blakey y Lesley-Anne Williams

Virología, Facultad de Ciencias de la Vida, Centro Médico de Queens, Universidad de Nottingham, Nottingham, Reino Unido

Patrick C. McClure, Joseph G. Chappell, Theocharis Tsoleridis y Jonathan Ball

Departamento de Microbiología Clínica, Queens Medical Centre, Nottingham, Reino Unido

Gemma Clark, Carl Jones, Wendy Smith, Manjinder Khakh, Vicki M. Fleming, Michelle M. Lister, Hannah C. Howson-Wells, Louise Berry, Tim Boswell, Amelia Joseph e Iona Willingham

PathLinks, Northern Lincolnshire & Goole NHS Foundation Trust, Scunthorpe, Reino Unido

Tim J. Sloan, Nichola Duckworth y Sarah Walsh

Hospital de Basingstoke, Basingstoke, Reino Unido

Jessica Lynch, Emma Wise, Nathan Moore, Matilde Mori, Nick Cortés y Stephen Kidd

Universidad de Surrey, Guildford, Reino Unido

Jessica Lynch, Emma Wise, Nathan Moore, Matilde Mori, Nick Cortés y Stephen Kidd

Fideicomiso de la Fundación NHS de los Hospitales Universitarios de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Ben Warne

Universidad de Swansea, Swansea, Reino Unido

Ronan A. Lyons

Ministerio de Salud, Colombo, Sri Lanka

Adhyana IK Mahanama y Buddhini Samaraweera

Cambridge Stem Cell Institute, Universidad de Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Nicola Reynolds y Michelle Wantoch

Laboratorios clínicos de Liverpool, Liverpool, Reino Unido

Jenifer Mason, Trevor I. Robinson, Elaine O'Toole, Joanne Watts, Cassie Breen y Angela Cowell

Unidad de Investigación de Protección de la Salud del NIHR en HCAI y AMR, Imperial College London, Londres, Reino Unido

Alison Holmes, James Price, Siddharth Mookerjee y Frances Bolt

Investigación de datos de salud del Reino Unido Cambridge, Cambridge, Reino Unido

Michael Chapman

Hampshire Hospitals NHS Foundation Trust, Winchester, Reino Unido

Gabrielle Vernet y Rebecca Williams

Agencia de Salud Pública, Londres, Reino Unido

Declan T. Bradley y Tim Wyatt

Departamento de Biología de Infecciones, Facultad de Enfermedades Infecciosas y Tropicales, Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, Londres, Reino Unido

Francesc Coll

Universidad de Birmingham, Birmingham, Reino Unido

Alex Richter y Andrew Beggs

Centro especializado en virología del oeste de Escocia, NHS Greater Glasgow and Clyde, Glasgow, Reino Unido

Rory N. Gunson

NHS Greater Glasgow y Clyde, Glasgow, Reino Unido

Amanda Bradley, Alasdair Maclean, Guy Mollett y Rachel Blacow

Servicio Nacional de Infecciones, PHE y Leeds Teaching Hospitals Trust, Leeds, Reino Unido

Antony D. Hale, Louissa R. Macfarlane-Smith, Katherine L. Harper y Holli Carden

Fundación NHS de la Universidad de Manchester, Manchester, Reino Unido

Nicholas W. Machin, Shazaad SY Ahmad y Ryan P. George

Hospitales Guy's y St Thomas', Londres, Reino Unido

Adela Alcolea-Medina

Viapath, Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust y King's College Hospital NHS Foundation Trust, Londres, Reino Unido

Adela Alcolea-Medina, Alberto C. Cerda, Tammy V. Merrill y Rebekah E. Wilson

Laboratorios de servicios de salud, Londres, Reino Unido

Lisa J. Levett, Judith Heaney, Wendy Chatterton y Monika Pusok

Maidstone y Tunbridge Wells NHS Trust, Maidstone, Reino Unido

Graciela Sluga

Gateshead Health NHS Foundation Trust, Gateshead, Reino Unido

Jonathan Moore y Susanne Stonehouse

Consejo del condado de Norfolk, Norwich, Reino Unido

Luisa Smith

Fideicomiso de la Fundación NHS de East Suffolk y North Essex, Ipswich, Reino Unido

Lucas Bedford

Departamento de Medicina, Universidad de Southampton, Southampton, Reino Unido

matilda mori

Departamento de Microbiología, Hospital Princess Alexandra, Harlow, Reino Unido

Nick Levene y Lynn Monaghan

Hospitales universitarios de Sheffield, Sheffield, Reino Unido

David G. Partridge, Mohammad Raza, Cariad Evans y Kate Johnson

Instituto de Biodiversidad, Sanidad Animal y Medicina Comparada, Glasgow, Reino Unido

Katherine L. Smollett

Departamento de Enfermedades Infecciosas, King's College London, Londres, Reino Unido

Adrian W. Signell, Gilberto Betancor & Harry D. Wilson

BRC de Guy y St Thomas, Londres, Reino Unido

Flavia Flaviani

Centro Wellcome Sanger, Hinxton, Reino Unido

Steven Rushton, Sarah O'Brien, Irina Abnizova, Louise Aigrain, Alex Alderton, Mozam Ali, Laura Allen, Roberto Amato, Ralph Anderson, Cristina Ariani, Siobhan Austin-Guest, Sendu Bala, Jeffrey Barrett, Andrew Bassett, Kristina Battleday, James Beal, Mathew Beale, Charlotte Beaver, Sam Bellany, Tristram Bellerby, Katie Bellis, Duncan Berger, Matt Berriman, Emma Betteridge, Paul Bevan, Simon Binley, Jason Bishop, Kirsty Blackburn, James Bonfield, Nick Boughton, Sam Bowker, Timothy Brendler. Spaeth, Iraad Bronner, Tanya Brooklyn, Sarah Kay Buddenborg, Robert Bush, Catarina Caetano, Alex Cagan, Nicola Carter, Joanna Cartwright, Tiago Carvalho Monteiro, Liz Chapman, Tracey-Jane Chillingworth, Peter Clapham, Richard Clark, Adrian Clarke, Catriona Clarke , Daryl Cole, Elizabeth Cook, Maria Coppola, Linda Cornell, Clare Cornwell, Craig Corton, Abby Crackett, Alison Cranage, Harriet Craven, Sarah Craw, Mark Crawford, Tim Cutts, Monika Dabrowska, Matt Davies, Robert Davies, Joseph Dawson, Callum Day, Aiden Densem, Thomas Dibling, Cat Dockree, David Dodd, Sunil Dogga, Matthew Dorman, Gordon Dougan, Martin Dougherty, Alexander Dove, Lucy Drummond, Eleanor Drury, Monika Dudek, Jillian Durham, Laura Durrant, Elizabeth Easthope, Sabine Eckert, Pete Ellis, Ben Farr, Michael Fenton, Marcella Ferrero, Neil Flack, Howerd Fordham, Grace Forsythe, Luke Foulser, Matt Francis, Audrey Fraser, Adam Freeman, Anastasia Galvin, María García-Casado, Alex Gedny, Sophia Girgis, James Glover, Sonia Goncalves, Scott Goodwin, Oliver Gould, Marina Gourtovaia, Andy Gray, Emma Gray, Coline Griffiths, Yong Gu, Florence Guerin, Will Hamilton, Hannah Hanks, Ewan Harrison, Alexandria Harrott, Edward Harry, Julia Harvison, Paul Heath, Anastasia Hernandez -Koutoucheva, Rhiannon Hobbs, Dave Holland, Sarah Holmes, Gary Hornett, Nicholas Hough, Liz Huckle, Lena Hughes-Hallet, Adam Hunter, Stephen Inglis, Sameena Iqbal, Adam Jackson, David Jackson, Keith James, Dorota Jamrozy, Carlos Jiménez Verdejo , Ian Johnston, Matthew Jones, Kalyan Kallepally, Leanne Kane, Keely Kay, Sally Kay, Jon Keatley, Alan Keith, Alison King, Lucy Kitchin, Matt Kleanthous, Martina Klimekova, Petra Korlevic, Ksenia Krasheninnkova, Dominic Kwiatkowski, Greg Lane, Cordelia Langford, Adam Laverack, Katharine Law, Mara Lawniczak, Stefanie Lensing, Steven Leonard, Laura Letchford, Kevin Lewis, Amanah Lewis-Wade, Jennifer Liddle, Quan Lin, Sarah Lindsay, Sally Linsdell, Rich Livett, Stephanie Lo, Rhona Long, Jamie Lovell, Jon Lovell, Catherine Ludden, James Mack, Mark Maddison, Aleksei Makunin, Irfan Mamun, Jenny Mansfield, Neil Marriott, Matt Martin, Inigo Martincorena, Matthew Mayho, Shane McCarthy, Jo McClintock, Samantha McGuigan, Sandra McHugh, Liz McMinn, Carl Meadows, Emily Mobley, Robin Moll, Maria Morra, Leanne Morrow, Kathryn Murie, Sian Nash, Claire Nathwani, Plamena Naydenova, Alexandra Neaverson, Rachel Nelson, Ed Nerou, Jon Nicholson, Tabea Nimz, Guillaume G. Noell, Sarah O' Meara, Valeriu Ohan, Karen Oliver, Charles Olney, Doug Ormond, Agnes Oszlanczi, Steve Palmer, Yoke Fei Pang, Barbora Pardubska, Naomi Park, Aaron Parmar, Gaurang Patel, Minal Patel, Maggie Payne, Sharon Peacock, Arabella Petersen, Deborah Plowman , Tom Preston, Liam Prestwood, Christoph Puethe, Michael Quail, Diana Rajan, Shavanthi Rajatileka, Richard Rance, Suzannah Rawlings, Nicholas Redshaw, Joe Reynolds, Mark Reynolds, Simon Rice, Matt Richardson, Connor Roberts, Katrina Robinson, Melanie Robinson, David Robinson, Hazel Rogers, Eduardo Martin Rojo, Daljit Roopra, Mark Rose, Luke Rudd, Ramin Sadri, Nicholas Salmon, David Saul, Frank Schwach, Carol Scott, Phil seeks, Lesley Shirley, John Sillitoe, Alison Simms, Matt Sinnott, Shanthi Sivadasan , Bart Siwek, Dale Sizer, Kenneth Skeldon, Jason Skelton, Joanna Slater-Tunstill, Lisa Sloper, Nathalie Smerdon, Chris Smith, Christen Smith, James Smith, Katie Smith, Michelle Smith, Sean Smith, Tina Smith, Leighton Sneade, Carmen Diaz Soria, Catarina Sousa, Emily Souster, Andrew Sparkes, Michael Spencer-Chapman, Janet Squares, Robert Stanley, Claire Steed, Tim Stickland, Ian Still, Mike Stratton, Michelle Strickland, Allen Swann, Agnieszka Swiatkowska, Neil Sycamore, Emma Swift, Edward Symons, Suzanne Szluha, Emma Taluy, Nunu Tao, Katy Taylor, Sam Taylor, Stacey Thompson, Mark Thompson, Mark Thomson, Nicholas Thomson, Scott Thurston, Gerry Tonkin-Hill, Dee Toombs, Benjamin Topping, Jaime Tovar-Corona, Daniel Ungureanu , James Uphill, Jana Urbanova, Philip Jansen Van, Valerie Vancollie, Paul Voak, Danielle Walker, Matthew Walker, Matt Waller, Gary Ward, Charlie Weatherhogg, Niki Webb, Danni Weldon, Alan Wells, Eloise Wells, Luke Westwood, Theo Whipp, Thomas Whiteley, Georgia Whitton, Andrew Whitwham, Sara Widaa, Mia Williams, Mark Wilson y Sean Wright

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DC, RKG y DAC concibieron el estudio. RKG, DAC, LEM, J. Bassi, MW, LC-G., GB-M., RD, BG, NK, AE, MSP, DV, LP, ADM, JRB y DC diseñaron el estudio y los experimentos. BM, DAC, NT, RPD, IATMF, ACW, LC-G., SAK y GB-M. experimentos realizados. RKG, DAC, BM, RD, IATMF, ACW, LEM, J. Bassi, KGCS y DV interpretaron los datos. ADM y CSF llevaron a cabo ensayos de neutralización de pseudovirus. DP produjo pseudovirus. MSP, LP, WH, DV y DC diseñaron los experimentos. MAT, J. Bassi y SJ expresaron y purificaron las proteínas. KC, SJ y EC secuenciaron y expresaron anticuerpos. EC y KC realizaron mutagénesis para crear plásmidos de expresión mutantes. ACW y SB realizaron ensayos de unión. AR, AFP y CG contribuyeron al reclutamiento de donantes y recolección de muestras relacionadas con el aislamiento de anticuerpos monoclonales. HWV, GS, AL, DV, LP, DV y DC analizaron los datos y prepararon el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Davide Corti o Ravindra K. Gupta.

ADM, J. Bassi, DP, CSF, SB, KC, NS, EC, GS, SJ, AL, HWV, MSP, LP y DC son empleados de Vir Biotechnology y pueden poseer acciones de Vir Biotechnology. HWV es fundador de PierianDx y Casma Therapeutics. Ninguna de las empresas proporcionó fondos para este trabajo ni realiza trabajos relacionados. DV es consultor de Vir Biotechnology. El laboratorio Veesler ha recibido un acuerdo de investigación patrocinado por Vir Biotechnology. RKG ha recibido honorarios de consultoría de UMOVIS Lab, Gilead y ViiV. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Información de revisión por pares Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Respuestas de IgG sérica contra la proteína N, la proteína de pico y el RBD de la proteína de pico de los participantes que recibieron una dosis de vacuna (verde claro) o dos dosis de vacuna (verde oscuro), pacientes que se habían recuperado de COVID-19 (rojo) y los individuos de control sanos (gris) se midieron mediante un ensayo Luminex basado en citometría de flujo. n = 25. MFI, intensidad media de fluorescencia. Los datos son GMT ± sd (líneas y barras de error) de dos repeticiones técnicas y valores individuales (círculos). b, Relación entre las respuestas de IgG sérica, medidas por citometría de flujo, y la neutralización sérica ID50. n = 25. c, Relación entre la neutralización sérica ID50 y las respuestas de las células T contra el SARS-CoV-2 mediante IFNγ FluoroSpot. n = 24. SFU, unidades formadoras de manchas. d, Relación entre las respuestas de IgG sérica y las respuestas de las células T. n = 23. b–d, Las regresiones lineales simples se muestran con correlación de Pearson (r), valor de P (p) y coeficiente/pendiente de regresión (β).

a, b, Dilución de los sueros vacunales para una neutralización del 50% contra los virus de tipo salvaje y mutante de pico (N501Y, A570D, ΔH69/ΔV70). b, Los datos son GMT ± sd (líneas y barras de error) de dos experimentos independientes con dos repeticiones técnicas y valores individuales (círculos). Prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon de dos colas sin ajuste para comparaciones múltiples; ***P < 0,001. c, d, Dilución de sueros convalecientes para una neutralización del 50% contra los virus de tipo salvaje y mutantes de pico (N501Y, A570D, ΔH69/ΔV70). Los datos son GMT ± sd (líneas de puntos y barras de error) de un experimento representativo con dos repeticiones técnicas y valores individuales (círculos). Prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon de dos colas sin ajuste para comparaciones múltiples; ns, no significativo. e, Curvas representativas de diluciones inversas transformadas con log10 de sueros convalecientes frente al porcentaje de neutralización para los virus de tipo salvaje y mutantes de pico (N501Y, A570D, ΔH69/ΔV70). En los casos en los que la curva se desplaza hacia la derecha, el virus es menos sensible a los anticuerpos neutralizantes del suero. Los datos son media ± sem de dos réplicas técnicas. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. El límite para una neutralización del 50% se estableció en 4 (líneas de puntos en a, b). a, c, Los puntos de datos del mismo individuo están conectados por líneas.

Todas las variantes del virus estaban en un fondo de pico (D614G). Las diluciones inversas transformadas en log10 de los sueros se muestran frente al porcentaje de neutralización. En los casos en los que la curva se desplaza hacia la derecha, el virus es menos sensible a los anticuerpos neutralizantes del suero. Los datos corresponden a la primera dosis de vacuna (D1). Los datos son media ± sem representativos de dos experimentos independientes, cada uno con dos réplicas técnicas.

Las diluciones inversas transformadas en log10 de los sueros se muestran frente al porcentaje de neutralización. En los casos en los que la curva se desplaza hacia la derecha, el virus es menos sensible a los anticuerpos neutralizantes del suero. Los datos son media ± sem representativos de dos experimentos independientes, cada uno con dos réplicas técnicas.

Todas las variantes del virus estaban en un fondo de pico (D614G). Potencia de neutralización de los sueros de la primera (izquierda; n = 37) y la segunda (centro, n = 21) dosis de vacuna y del plasma de convaleciente (PC) (derecha; n = 27) contra el SARS-CoV-2 de tipo salvaje , la variante B.1.1.7 con pico(N501Y, A570D, ΔH69/ΔV70, Δ144, P681H, T716I, S982A, D1118H) y la variante B.1.1.7 con pico(N501Y, A570D, ΔH69/ΔV70, Δ144, P681H, T716I, S982A, D1118H) y la sustitución adicional E484K. Los datos son GMT ± sd representativos de dos experimentos independientes, cada uno con dos repeticiones técnicas. Prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon; **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

a – c, Neutralización del pico de tipo salvaje (negro), pico B.1.1.7 (azul) y pico (N501Y, E484K, K417N) (TM) (rojo) SARS-CoV-2–MLV por 9 NTD- anticuerpos monoclonales dirigidos a (a), 29 dirigidos a RBM (b) y 19 no dirigidos a RBM (c). Los datos son la media ± DE de dos réplicas técnicas de un experimento representativo.

ab, a, b, Unión al RBD del SARS-CoV-2 de tipo salvaje (negro) y de pico (N501Y) (azul) por 22 anticuerpos monoclonales dirigidos a RBM (a) y 21 no dirigidos a RBM (b) . Se incluyó un anticuerpo de especificidad irrelevante como control negativo.

a, b, Unión al RBD del SARS-CoV-2 de tipo salvaje (negro) y de pico (E484K) (rojo) por 27 anticuerpos monoclonales dirigidos a RBM (a) y 19 no dirigidos a RBM (b). Se incluyó un anticuerpo de especificidad irrelevante como control negativo.

a-c, análisis de unión de interferometría de biocapa del ectodominio humano ACE2 (huACE2) (residuos 1 a 615) al RBD inmovilizado del SARS-CoV-2 de tipo salvaje (a) y al RBD del pico B.1.1.7 (N501Y) (b) y proteínas de pico (N501Y, E484K, K417N) (c). Las líneas negras corresponden a un ajuste global de los datos utilizando un modelo de enlace 1:1.

Neutralización, uso del gen V y otras propiedades de los mAb probados.

Agradecimientos GISAID.

Reimpresiones y permisos

Collier, DA, De Marco, A., Ferreira, IATM et al. Sensibilidad del SARS-CoV-2 B.1.1.7 a los anticuerpos provocados por la vacuna de ARNm. Naturaleza 593, 136-141 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03412-7

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Recibido: 26 de enero de 2021

Aceptado: 01 de marzo de 2021

Publicado: 11 de marzo de 2021

Fecha de emisión: 06 de mayo de 2021

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03412-7

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